靶向TGFβ1的shRNA干擾載體介導(dǎo)人增生性瘢痕基因治療的實驗研究.pdf

1、皮膚損傷后膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，可形成病理性瘢痕(增生性瘢痕或瘢痕疙瘩)，不僅影響外表的完美，嚴(yán)重者可致功能為功能障礙。對病理性瘢痕的防治一直是臨床研究的重要課題。瘢痕成纖維細(xì)胞是瘢痕形成過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性近來被認(rèn)為是病理性瘢痕發(fā)病的重要機制。而轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFB)是目前已知的與瘢痕形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子。在體外實驗中，TGFβ1可增加膠原、纖連蛋白、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成。合成的

2、TGFβ1對瘢痕組織中Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因的表達(dá)起誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用。由于TGFβ1與瘢痕形成的關(guān)系密切，因此，抗TGFβ1治療就有可能成為治療瘢痕的有效途徑。 目前，關(guān)于病理性瘢痕的基因治療已經(jīng)開展了很多，許多學(xué)者嘗試應(yīng)用反義寡核苷酸、核酶的方法抑制TGFβ1的表達(dá)，但是，存在著轉(zhuǎn)到效率低下，作用時間短暫缺點等。隨著RNA干擾(RNA interference)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為增生性瘢痕的基因治療帶來了新辦法。RNA干擾是指外源性或內(nèi)源

3、性雙鏈觸發(fā)靶基因轉(zhuǎn)錄的同源序列mRNA特異地降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)功能缺失，這個過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。因其具有特異性、高效性持久性而得到應(yīng)用。而應(yīng)用RNA干擾技術(shù)治療增生性瘢痕的研究，國內(nèi)外報道的還很少。 目的：通過載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)抑制TGFβ1的表達(dá)，以達(dá)到抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，明確shRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達(dá)的影響。 方法：根據(jù)siRNA設(shè)計原則，針對人TGFβ1基因序列特征構(gòu)建特異

4、性shRNA載體，轉(zhuǎn)染增生性瘢痕培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞；應(yīng)用Real time RT-PCR，ELISA檢測shRNA對TGFβ1基因及TGFβ1蛋白表達(dá)的抑制效果，同時MTT方法檢測細(xì)胞增殖情況。ShRNA TGFβ1轉(zhuǎn)染增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，Real time RT-PCR檢測ShRNA TGFβ1轉(zhuǎn)染后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原及Smads通路基因表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.DNA載體介導(dǎo)的TGFβ1 pSUPER可

5、以有效的抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGFβ1基因的表達(dá)； 2.TGFβ1 pSUPER抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGFβ1基因的表達(dá)存在良好的時間、劑量依賴性： 3.TGFβ1 pSUPER轉(zhuǎn)染可有效抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原基因的表達(dá)； 4.TGFβ1 pSUPER轉(zhuǎn)染可有效抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF/Smad信號通路下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2、Smad3的表達(dá)； 5.體外實驗證實細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異