急性胰腺炎時(shí)自噬變化的意義及干擾素γ對(duì)自噬影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急癥，國(guó)外報(bào)告其發(fā)病率10/105～44/105，近年來(lái)呈升高趨勢(shì)。約20％患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達(dá)15％～30％，病情危重，預(yù)后兇險(xiǎn)，已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的重要?dú)⑹?。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)急性胰腺炎的防治進(jìn)行了多年的研究，但迄今還沒(méi)有針對(duì)急性胰腺炎特效的防治措施，其原因與目前對(duì)急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不夠深入有關(guān)。因此，深入研究

2、急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，探索急性胰腺炎啟動(dòng)的關(guān)鍵過(guò)程，不僅具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，而且將有助于尋找和建立有針對(duì)性的救治方法，以期提高急性胰腺炎的救治水平，具有重要的的意義。
　　 自噬是廣泛存在于真核生物中的生命現(xiàn)象，屬程序性細(xì)胞死亡的一種。自噬發(fā)生時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)形成“雙層膜”結(jié)構(gòu)的囊泡即自噬體，包裹胞質(zhì)成分和某些細(xì)胞器碎片，送入溶酶體中并進(jìn)行多種酶的消化及降解，為細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)提供能量和小分子物質(zhì)。自噬是急性胰腺炎早期發(fā)生的事件，在急性

3、胰腺炎中的作用機(jī)制存在很多爭(zhēng)議。有學(xué)者采用敲除自噬相關(guān)基因小鼠研究后發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎減輕，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白減少，推測(cè)自噬在急性胰腺炎中被誘導(dǎo)增強(qiáng)，自噬對(duì)胰腺起損害作用;有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎中長(zhǎng)壽蛋白的降解大大減少（長(zhǎng)壽蛋白通過(guò)自噬途徑降解），大量空泡聚集，認(rèn)為自噬在急性胰腺炎中下降，自噬對(duì)胰腺起保護(hù)作用;另外有學(xué)者認(rèn)為自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，自噬過(guò)程在急性胰腺炎中被破壞，自噬和胰腺炎起相互促進(jìn)作用。這些相互矛盾結(jié)果顯示自噬在急性胰腺炎

4、發(fā)生中存在很大的爭(zhēng)議。
　　 干擾素γ是一種來(lái)自T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清的蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增殖作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ可促進(jìn)自噬。另有文獻(xiàn)報(bào)告干擾素γ對(duì)急性胰腺炎有一定影響。為了進(jìn)一步探討自噬在急性胰腺炎發(fā)生過(guò)程中的變化及其病理意義，并觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎及自噬的影響，并探討其作用機(jī)制，擬開展本實(shí)驗(yàn)研究。
　　 研究目標(biāo)：
　　 1.建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過(guò)程中自噬活性的變化

5、，探討其病理意義。
　　 2.觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎炎癥及自噬的影響，初步探討其機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 圍繞上述目標(biāo)，本研究采用以下研究方法:
　　 1.動(dòng)物模型的建立
　　 采用左旋精氨酸400mg/100g（腹腔注射，2次，間隔1小時(shí)）方法，構(gòu)建急性胰腺炎大鼠模型。
　　 2.電鏡
　　 大鼠新鮮胰腺組織取下后立即置于25％戊二醛電鏡固定液中，切成1mm3大小組織塊，

6、送電鏡室，于透射電鏡下觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。
　　 3.ELISA
　　 大鼠麻醉開腹后，心臟取血2～5ml置于抗凝管內(nèi)，靜止2h后，3000rpm離心5min，取上清，置于-80℃冰箱低溫凍存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)于4℃靜置解凍，用R&D試劑盒行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)AMY、TAP的濃度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平。
　　 4.HE染色
　　 標(biāo)本置于4％中性緩沖甲醛中固定24小時(shí)，組織脫

7、水石蠟包埋，室溫保存，行HE染色后觀察胰腺炎癥程度。
　　 5.免疫組化
　　 經(jīng)漂洗，封閉，一抗和二抗孵育后檢測(cè)LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺組織中的表達(dá)。
　　 6.Western Blot
　　 經(jīng)過(guò)提取蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記一抗和二抗、曝光等步驟觀察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表達(dá)。
　　 7.qRT-PCR
　　 通過(guò)RNA提

8、取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的方法檢測(cè)胰腺組織LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表達(dá)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 全部數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，取P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示;兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊時(shí)采用LSD-t或SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)

9、采用Dunnett's T3或Dunnett's C檢驗(yàn)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.20％L-精氨酸腹腔注射可構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型
　　 先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同給藥劑量的20％L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400mg/100g的劑量腹腔注射2次，間隔1小時(shí)造模，可成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。
　　

10、 2.急性胰腺炎誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生
　　 免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，大鼠急性胰腺炎模型組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1的蛋白與mRNA表達(dá)顯著上調(diào);電鏡觀察發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯多于對(duì)照組。結(jié)果證實(shí)急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生。
　　 3.調(diào)控自噬可影響胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的損傷程度
　　 分別采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉

11、素(RAP)和自噬阻斷劑氯喹(CQ)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)調(diào)控自噬活性，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬后TAP明顯升高，阻斷自噬后TAP下降;SAP9h后誘導(dǎo)劑組大鼠胰腺壞死病理評(píng)分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組與急性胰腺炎組無(wú)明顯差別，24h后誘導(dǎo)劑組胰腺壞死評(píng)分高于急性胰腺炎組，阻斷劑組胰腺壞死評(píng)分低于急性胰腺炎組。結(jié)果表明急性胰腺炎時(shí)自噬可促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，并參與胰腺的損傷。
　　 4.干擾素γ在急性胰腺炎時(shí)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生及自噬體和

12、溶酶體的融合
　　 與急性胰腺炎對(duì)照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ，免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)均表明自噬相關(guān)因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào);溶酶體相關(guān)膜蛋白-2(Lamp-2)蛋白和基因表達(dá)亦明顯上調(diào)。結(jié)果表明干擾素γ可進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并促進(jìn)自噬體和溶酶體的融合。
　　 5.干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎時(shí)胰腺的損傷
　　 與急性

13、胰腺炎對(duì)照組相比，急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ后胰腺水腫、炎癥、壞死、出血評(píng)分明顯增高;血漿炎癥因子IL-6濃度明顯升高，TAP在各時(shí)間點(diǎn)均明顯上升;淀粉酶峰值前移。結(jié)果表明干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活，并加重急性胰腺炎時(shí)的炎癥反應(yīng)與胰腺損傷。
　　 6.急性胰腺炎時(shí)干擾素γ可能通過(guò)Ⅲ型PDK通路來(lái)誘導(dǎo)自噬和加重炎癥
　　 qRT-PCR顯示干擾素γ組Ⅲ型PI3K復(fù)合物(vps34) mRNA明顯高于急性胰腺炎對(duì)照組