自噬在大鼠急性壞死性胰腺炎中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是胰酶提前激活造成胰腺及周圍組織消化所引起的急性炎癥性疾病。根據(jù)病情輕重，臨床分為輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎，輕癥患者病情輕、大多預(yù)后良好，而重癥臨床病情兇險，可發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）并發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)，甚至導(dǎo)致患者死亡。然而目前臨床對于重癥急性胰腺炎缺乏確切有效的治療措施，關(guān)鍵是對其發(fā)生機(jī)制不清楚。
　　 自噬是近年來提出的新的細(xì)胞死亡方

2、式，隨著對自噬的不斷認(rèn)識，目前認(rèn)為自噬與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但自噬在急性胰腺炎中的研究才剛剛起步，現(xiàn)認(rèn)為急性胰腺炎自噬體增加，且異常自噬與酶原的激活有關(guān)，故我們推測抑制自噬發(fā)生或阻斷其過程可能成為治療急性胰腺炎的一個潛在靶點(diǎn)。因此本研究通過建立大鼠急性壞死性胰腺炎動物模型，觀察自噬在胰腺炎中表達(dá)變化及意義；運(yùn)用自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）干預(yù)自噬發(fā)生，明確自噬在胰腺炎中的作用及機(jī)制，并運(yùn)

3、用NF-kB抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)干預(yù)NF-kB信號通道，觀察NF-kB信號通道對大鼠急性胰腺炎自噬的調(diào)節(jié)作用，探討NF-kB信號通路對自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制，初步探尋急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展新的分子機(jī)制，從而為研究和探索早期遏制急性胰腺炎尤其是重癥急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展、改善患者預(yù)后提供新的治療策略。
　　 第一部分，自噬在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺中的表達(dá)及意義

4、>　　 目的：觀察自噬在?；悄懰徕c所致的急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺中的表達(dá)及意義。
　　 方法：健康SD大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)(SO)組和ANP組，各組再分為術(shù)后3h、6h、12h3個觀察亞組，每亞組6只。采用胰膽管插入逆行注射5％?；悄懰徕c制備ANP大鼠模型。各組于術(shù)后相應(yīng)時點(diǎn)處死大鼠，檢測血清淀粉酶(AMY)，ELISA法測血清TNF-α，HE染色觀察胰腺組織病理學(xué)變化及評分，酶組織化學(xué)法檢測胰腺組織髓過氧化物

5、酶(MPO)濃度，電鏡觀察自噬形成，免疫組化和Westernblot法分別檢測自噬相關(guān)基因LC3和Beclinl蛋白不同時間點(diǎn)在胰腺組織的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與SO組比較，?；悄懰徕c誘導(dǎo)ANP各時間點(diǎn)(3h、6h、12h)血清AMY、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，胰腺損傷及（水腫、出血、壞死和炎癥）病理學(xué)評分均顯著增加(P＜0.05)。因此，采用5%?；悄懰徕c逆行胰膽管注射成功地建立了急性壞死性胰腺炎大鼠模型。電鏡下

6、，正常胰腺腺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞內(nèi)自噬泡少見；ANP誘導(dǎo)后自噬體增加，隨時間延長數(shù)量增多。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，正常胰腺組織中LC3和Beclinl低表達(dá)，ANP后3h大鼠胰腺組織中LC3和Beclinl陽性細(xì)胞表達(dá)增加，持續(xù)到12h，較SO組明顯升高(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，ANP組LC3及Beclin1蛋白表達(dá)升高，與SO組比較，各時間點(diǎn)均有差異(P＜0.05)。LC3蛋白表達(dá)水平在6h和12h與

7、胰腺病理損傷程度有相關(guān)性(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠ANP發(fā)生，導(dǎo)致大鼠胰腺細(xì)胞自噬激活，自噬體形成，并且胰腺組織Beclinl和LC3的表達(dá)在3h增加持續(xù)至12h，呈時間依賴性增高，與胰腺病理損傷相關(guān)。提示自噬激活參與ANP早期損傷，Beclinl和LC3在ANP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　 第二部分，自噬抑劑3-MA對大鼠急性壞死性胰腺炎自噬及凋亡的影響
　　 目的：采用自噬特異性抑制劑

8、3-MA進(jìn)行干預(yù)，探討抑制自噬對大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)的作用及其對胰腺細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：54只健康SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)(SO)組、ANP組和3-MA組，各組再分為術(shù)后3h、6h、12h3個亞組，每亞組6只。各組于術(shù)后相應(yīng)時間點(diǎn)處死大鼠，采集血清和胰腺組織。采用ELISA法檢測血清胰蛋白酶原激活肽(TAP)，HE染色觀察胰腺組織病理變化并進(jìn)行評分，TUNEL法檢測胰腺組織凋亡指數(shù)，免疫熒光檢測LC3和Bcl-

9、2在胰腺組織中的表達(dá)，免疫組化觀察胰腺組織Caspase-3的表達(dá)及酶化學(xué)法測定胰腺組織Caspase-3的活性，RT-PCR檢測胰腺組織Caspase-3和Bcl-2mRNA的變化。
　　 結(jié)果：與SO組比較，ANP組和3-MA組血清TAP在各時間點(diǎn)均升高,3-MA組的TAP在3h和6h較ANP組下降(P＜0.05)，但12h兩者之間比較無差異(P＞0.05)。病理檢測顯示，與ANP組比較,3-MA組病理損傷和評分在3h和6h

10、下降(P＜0.05)，12h兩組間無差異(P＞0.05)。TUNEL檢測凋亡指數(shù)在ANP組較SO組升高(P＜0.05),3-MA組在3h和6h較ANP組升高(P＜0.05)，12h兩組間無差別(P＞0.05)。免疫熒光顯示,3-MA組胰腺細(xì)胞LC3和Bcl-2表達(dá)較ANP組下降，RT-PCR結(jié)果顯示Bcl-2mRNA含量在各時間點(diǎn)也減少(P＜0.05)。與ANP組比較,3-MA組大鼠胰腺組織Caspase-3活性在3h和6h增加，而且C

11、aspase-3mRNA在胰腺組織含量也增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：3-MA抑制自噬后，大鼠ANP的胰腺病理損傷減輕和血清TAP水平降低，Caspase-3升高和Bcl-2下降。表明ANP胰腺細(xì)胞自噬受到抑制后，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的形成；胰腺病理損傷減輕和血清TAP水平降低可能與腺泡細(xì)胞的凋亡增加有關(guān)。
　　 第三部分，NF-kB對大鼠急性壞死性胰腺炎自噬的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：探討NF-kB信號通道對大鼠急

12、性胰腺壞死性胰腺炎胰腺自噬的調(diào)節(jié)及分子機(jī)制。
　　 方法：健康SD大鼠54只，隨機(jī)分為假手術(shù)(SO)組、ANP組和PDTC組。PDTC于建立ANP前30min腹腔注射，各組再分為術(shù)后3h、6h、12h3個亞組，每亞組6只。采用胰膽管插入逆行注射5%?；悄懰徕c制備ANP大鼠模型。各組于術(shù)后相應(yīng)時點(diǎn)處死大鼠，采集血清和胰腺組織。檢測血清AMY、ELISA測定血清TNF-α、TAP，HE染色觀察胰腺組織病理變化及評分，電鏡觀察自噬形成

13、，免疫組織化學(xué)和Westernblot檢測NF-kBp65、Beclinl和LC3蛋白在胰腺組織表達(dá)。
　　 結(jié)果：5%牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)ANP大鼠血清AMY、TNF-α、TAP在各時間點(diǎn)均較SO組明顯升高(P＜0.05)，胰腺病理損傷逐漸加重。免疫組化和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)胰腺組織NF-kBp65、Beclinl和LC3在各時間點(diǎn)均升高(P＜0.05)。PDTC干預(yù)NF-kB信號通道后減輕大鼠血清AMY、TNF-α、TA