自噬在大鼠重癥急性胰腺炎腸粘膜屏障中的表達及意義.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)發(fā)病急、進展快、病情重、并發(fā)癥多，是常見的消化系統(tǒng)疾病，不僅胰腺局部水腫、出血、壞死，往往還伴有其他臟器功能障礙，因此明確SAP的發(fā)病機制有重要意義。大量研究證實SAP時，腸道粘膜屏障損傷介導(dǎo)的生理病理改變在其發(fā)病過程中起到了非常關(guān)鍵的作用，是并發(fā)感染、形成腹腔積液、膿腫，誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response

2、syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)，導(dǎo)致患者死亡的原因所在。
　　自噬，被稱為Ⅱ型程序性死亡，是近年來備受關(guān)注的領(lǐng)域，已有多項研究證實自噬與很多疾病相關(guān)，但關(guān)于自噬在腸粘膜屏障中發(fā)揮的作用研究較少，已有研究發(fā)現(xiàn)腸粘膜屏障損傷中存在自噬表達，但機制及作用尚有待進一步探索，因此本研究通過建立重癥急性胰腺炎模型，觀察自噬在腸粘膜中的表達變化

3、，并運用四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)，即核因子(NF)-κB抑制劑，探討NF-κB信號通路對腸粘膜自噬的調(diào)節(jié)，探尋急性胰腺炎發(fā)生腸粘膜屏障損傷新的分子機制，為治療SAP提供新的治療策略。
　　目的:觀察自噬在左旋-精氨酸腹腔內(nèi)注射所致重癥急性胰腺炎大鼠腸粘膜中的表達及意義。
　　方法:120只成年清潔級SD大鼠，平均體重為250±30g，隨機分為正常對照組(N)

4、組、重癥急性胰腺炎模型(SAP)組和PDTC組，其中PDTC組根據(jù)劑量不同分為1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg三組，分別記為P1、P10、P100。每個組又分為12h和24h兩個時間點，共10組每組12只大鼠。實驗前大鼠禁食12h，自由飲水，分兩次腹腔注射20％左旋-精氨酸，每次均為2.5g/kg，間隔1h，誘導(dǎo)大鼠SAP模型;PDTC組在建立SAP模型前1h分別按1mg/kg、10mg/kg、100mg/kg進行腹腔注射

5、;對照組腹腔注射等體積0.9％氯化鈉。完成后分別在12h、24h處死大鼠，取血清、胰腺、小腸組織。
　　HE染色后光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠胰腺及小腸組織病理切片，Westernblot法檢測自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1蛋白及NF-κBp65蛋白在小腸組織中的含量，腸道組織勻漿后測定超氧化物歧化酶(SOD)及丙二酫(MDA)含量，ELISA方法檢測血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Ⅰ-FABP)。
　　結(jié)果:1、胰腺組織病理學(xué)改變:

6、對照組(N):胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，腺泡小葉及腺體清晰可見，無出血及壞死，12h、24h兩時間點無差別。模型組(SAP):胰腺小葉間高度水腫，腺泡細胞空泡變嚴重，小葉內(nèi)炎細胞廣泛浸潤，并看可見片狀壞死和出血，24h比12h，以上情況更加多見。干預(yù)組(P1、P10、P100):各組亦呈較明顯的炎癥變化，其中P100組最嚴重，可見彌漫性腺泡細胞壞死，部分腺泡呈孤島狀，P10組及P1組胰腺炎癥明顯減輕。
　　2、腸道組織病理學(xué)改變:對照組(

7、N):腸粘膜絨毛排列整齊，上皮細胞層完整，刷狀緣光滑，未見明顯炎癥表現(xiàn)。組內(nèi)兩時間點無差別。模型組(SAP):腸粘膜上皮細胞變性、壞死，部分脫落以至固有層裸露，絨毛變短、排列紊亂，固有層大量中性粒細胞浸潤，毛細血管擴張、充血，24h比12h，粘膜破壞更明顯。干預(yù)組(P1、P10、P100):腸粘膜炎癥損傷程度中P100組最嚴重，P1、P10組粘膜破壞程度減輕。
　　3、血清Ⅰ-FABP:兩時間點中SAP組Ⅰ-FABP表達明顯高于N

8、組（P＜0.05);應(yīng)用不同劑量PDTC干預(yù)后，與SAP組比較P1、P10組表達降低，但較對照組高（P＜0.05），而P100組較SAP組無明顯變化（P＞0.05）;在12h，P1與P10組無差異，在24h結(jié)果中，P10組Ⅰ-FABP表達低于P1組（P＜0.05），SAP、P1兩組24h較12h有明顯升高（P＜0.05），其余三組不同時間點無差異（P＞0.05）。
　　4、小腸組織勻漿Beclin1:與正常對照組比較，12h及24

9、hSAP組Beclin1明顯升高（P＜0.05），給予PDTC預(yù)處理后，與SAP組比較，無論12h及24h，P1及P10表達均減低（P＜0.05），而P100組在12h與SAP組比較無明顯差異（P＞0.05），在24h則高于SAP組;在兩不同時間點，P1與P10均無差異（P＞0.05）;各組24h與12h比較，除P100組24h較12h表達增高外（P＜0.05)，余四組無差異（P＞0.05）。
　　5、小腸組織勻漿LC3:與正常對

10、照組比較，SAP組LC3在12h及24h均明顯升高（P＜0.05），給予PDTC預(yù)處理后，無論12h及24h，P1及P10表達均較SAP組減低，而P100組LC3表達較SAP組明顯升高（P＜0.05），P1與P10在同時間點無顯著差異（P＞0.05);各組24h與12h比較，除正常對照組外，SAP、P1、P10、P100組24h均較12h表達增高外（P＜0.05)。
　　6、小腸組織勻漿p65:12h與24h結(jié)果趨勢一致，均為SA

11、P組較N組明顯增高，予PDTC干預(yù)后，P1、P10兩組結(jié)果較SAP組明顯減低，但較對照組高（P＜0.05），P100與SAP組相比無明顯差異（P＞0.05)，其中P10組較P1組低（P＜0.05）;五不同處理組24h與12h結(jié)果相比，SAP、P1、P100三組隨時間增長蛋白表達增高（P＜0.05），對照組及P10組兩時間點無明顯差異（P＞0.05）。
　　7、小腸組織勻漿MDA:12h與24h兩時間點均為SAP組最高，N組最低，P

12、DTC干預(yù)使P1與P10組較SAP組降低，但仍較N組高（P＜0.05)，同時間點SAP組與P100組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），P1與P10組在12h的結(jié)果無顯著差異（P＞0.05），在24h則P1較P10高;各組24h與12h比較，24hSAP組、P100組及P1均較12h增高（P＜0.05），P1與N組則兩時間點結(jié)果無差異（P＞0.05）。
　　8、小腸組織勻漿SOD:在兩時間點，SAP組均明顯較對照組N低（P＜0.05），

13、干預(yù)后，在12h，P1組無明顯升高，與SAP組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），P100組較SAP低，P10組較SAP組高，但仍較N組低（P＜0.05）;在24h，SAP、P100組SOD值較12h減低，P10組SOD值較12h升高，P1組則無明顯變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論:1、腹腔注射L-精氨酸可以成功建立大鼠重癥急性腺炎模型，造成胰腺損傷，同時形成腸道粘膜屏障損傷。
　　2、適量NF-κB抑制劑PDTC干預(yù)有助于促進急