干擾素-γ及自噬相關(guān)基因ATG5缺陷對(duì)APC突變所致腸道腫瘤的影響.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)腸癌嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。在西方國(guó)家，結(jié)腸癌成為第二高發(fā)癌癥，并且，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多階段，由多基因參與的分子病理學(xué)過(guò)程。臨床上，約85％的散發(fā)性結(jié)腸癌病人攜帶有腺瘤息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)的突變，APC基因突變?cè)谠缙诳蓪?dǎo)致結(jié)直腸腺瘤，而大部分結(jié)腸癌源于結(jié)腸腺瘤，腺瘤癌變一般需要十幾年時(shí)間。
　　干擾素-γ（Interferon

2、-gamma，IFN-γ）作為一種具有抗癌活性的內(nèi)源蛋白質(zhì)，受到人們廣泛關(guān)注。除了重要的抗腫瘤作用外，IFN-γ還具有抗病毒、抗微生物、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡與分化和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。最近的研究報(bào)道，IFN-γ及其受體基因的突變與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其預(yù)后有著密切的聯(lián)系。然而，關(guān)于IFN-γ及其受體在結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中的作用及意義尚不明確。本論文第一部分借助經(jīng)典的APC突變所致腸道腫瘤模型（ApcMin/+小鼠模型）以及APC基

3、因突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞，探討了干擾素-γ及其受體基因突變對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制做了深入研究。
　　細(xì)胞自噬是細(xì)胞對(duì)內(nèi)外壓力的一種適應(yīng)性反應(yīng)，細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，形成自噬溶酶體，降解所包裹的內(nèi)容物，藉此促進(jìn)細(xì)胞的存活和恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene-5，ATG5)是自噬過(guò)程中一種重要的ATG基因，參與早期自噬體的形成，在細(xì)胞自噬過(guò)程起到了

4、重要的作用。ATG5蛋白在正常結(jié)腸細(xì)胞中有表達(dá)，而在23％的結(jié)直腸癌患者中發(fā)生缺失。盡管發(fā)病率較低，但ATG5基因缺陷可能在結(jié)腸癌的發(fā)病過(guò)程中起了重要作用。此外，體外研究表明，ATG5基因經(jīng)小干擾RNAs(small interfering RNAs，siRNAs)沉默后可以大大增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。在第二部分，我們利用ApcMin/+小鼠模型和APC基因突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞，探討了ATG5基因缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道

5、腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了ATG5基因缺陷可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤的敏感性。
　　第一部分 IFN-γ基因缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤的影響
　　第一節(jié)內(nèi)源性IFN-γ基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討內(nèi)源性IFN-γ基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:選用經(jīng)典的腸道腺瘤模型ApcMin/+小鼠模型以及IFN-γ基因缺陷的小鼠IFN-

6、γ-/-或IFN-γ+/-小鼠，通過(guò)雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代雙基因缺陷的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠。通過(guò)比較子代ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠與ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠腸道腺瘤大小和數(shù)目，確定IFN-γ缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響;通過(guò)組織病理學(xué)檢查得出IFN-γ缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤惡性程度的影響;ELISA法檢測(cè)IFN-γ基因缺陷對(duì)小鼠血清IFN-γ水平的影響;免疫組化法檢

7、測(cè)IFN-γ缺陷對(duì)腸道腫瘤微環(huán)境中免疫因子數(shù)量和分布的調(diào)節(jié)作用;進(jìn)一步對(duì)腸道腫瘤進(jìn)行westernblotting分析，檢測(cè)IFN-γ基因缺陷對(duì)腫瘤組織中IFN-γ信號(hào)通路、Wnt/β-catenin以及EGFR/Erk1/2等信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:小鼠正常飼養(yǎng)至6月齡時(shí)，大多數(shù)ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠狀態(tài)良好，而接近半數(shù)的ApcMin/+IFN-γ+/-小、鼠發(fā)生死亡，其余存活的ApcMin/+IFN-

8、γ+/-小鼠狀態(tài)較差，大多出現(xiàn)便血或脫肛。解剖發(fā)現(xiàn)，與ApcMin/+IFN-γ+/+小鼠相比，ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠腸道腺瘤的大小和數(shù)目都有顯著的增加。組織病理學(xué)結(jié)果表明，41.7％的ApcMin/+IFN-γ+/-小鼠的腸道腺瘤發(fā)生了癌變。ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雜合性的IFN-γ缺陷降低了小鼠血清中IFN-γ水平;免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，IFN-γ缺陷可以調(diào)節(jié)腸道腫瘤微環(huán)境中免疫因子CD4、CD8及F4/80的數(shù)量和分布，

9、進(jìn)而限制了ApcMin/+小鼠的抗腫瘤細(xì)胞免疫能力。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雜合性IFN-γ缺陷對(duì)IFN-γ信號(hào)通路具有一定的抑制作用，并且激活了腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和 EGFR/Erk1/2，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。因此，IFN-γ缺陷可以促進(jìn)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的發(fā)展，并且可以促使良性的ApcMin/+小鼠腸道腺瘤發(fā)生癌變。這一作用可能與IFN-γ缺陷對(duì)Wnt/β-catenin和EGFR/E

10、rk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的活化作用有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:IFN-γ在APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了限速因子的角色，這個(gè)結(jié)果揭示了IFN-γ在癌癥生物學(xué)中的一個(gè)新的作用。
　　第二節(jié)干擾素-γ受體基因缺陷對(duì)APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)體外試驗(yàn)，檢測(cè)IFN-γ受體基因發(fā)生缺失對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000進(jìn)

11、行小干擾RNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，下調(diào)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的IFNγR1基因水平;使用western blotting法檢測(cè)IFNγR1蛋白的表達(dá)水平，確定IFNγR1基因的沉默效率。通過(guò)MTT法檢測(cè)IFN-γ對(duì)HT-29細(xì)胞以及IFNγR1基因沉默的HT-29細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證IFNγR1基因的沉默效果;通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFNγR1沉默對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響;通過(guò)使用western blotting法

12、檢測(cè)IFNγR1沉默對(duì)HT-29細(xì)胞中Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的影響。使用MTT法反方向驗(yàn)證外源性IFN-γ對(duì)HT-29和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，通過(guò)westernblotting法檢測(cè)IFN-γ抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過(guò)lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染IFNγR1-target siRNA，下調(diào)了HT-29細(xì)胞中IFNγR1水平，weste

13、rn blotting試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA可以顯著降低HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的IFNγR1蛋白水平，沉默效率達(dá)70％以上。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IFN-γ對(duì)IFNγR1沉默的HT-29細(xì)胞的抑制作用不敏感，從而進(jìn)一步證實(shí)了IFNγR1蛋白水平被有效下調(diào)。細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)得出，與沉默無(wú)關(guān)序列相比，沉默IFNγR1后HT-29細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)。Western blotting結(jié)果顯示IFNγR1沉默顯著促進(jìn)了Wnt/β-catenin和

14、EGFR/Erk1/2信號(hào)通路。進(jìn)一步MTT檢測(cè)結(jié)果表明，IFN-γ可顯著抑制APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性，而IFN-γ對(duì)野生型APC基因背景的HCT-116人源結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。利用western blotting方法進(jìn)一步檢測(cè)了IFN-γ對(duì)HT-29細(xì)胞的作用機(jī)制，結(jié)果表明，IFN-γ刺激促進(jìn)了STAT1磷酸化，激活了HT-29細(xì)胞中的IFN-γ信號(hào)通路，并且，IFN-γ

15、可抑制HT-29細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，通過(guò)增加β-catenin的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的降解。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:IFN-γ可顯著抑制APC突變背景的人源結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，而對(duì)野生型APC基因背景的HCT-116人源結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響。沉默IFNγR1可促進(jìn)HT-29細(xì)胞的克隆形成，此作用可能與對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

16、>　　第二部分自噬相關(guān)基因ATG5缺陷對(duì)APC突變誘發(fā)的腸道腫瘤的影響
　　第一節(jié)內(nèi)源性ATG5基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的影響（體內(nèi)試驗(yàn)）
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?探討內(nèi)源性ATG5基因缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤發(fā)展的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:由于ATG5-/-小鼠是無(wú)法存活的，在這里，我們使用腸道腺瘤模型小鼠ApcMin/+以及ATG5基因雜合性缺失的ATG5+/-小鼠，通過(guò)雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代A

17、TG5缺陷的ApcMin/+小鼠模型。通過(guò)比較子代ApcMin/+ATG5+/+與ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的大小和數(shù)目，確定ATG5缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤生長(zhǎng)的影響;通過(guò)組織病理學(xué)試驗(yàn)得出ATG5缺陷對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤惡性程度的影響;進(jìn)一步對(duì)腸道腫瘤進(jìn)行western blotting分析，檢測(cè)ATG5缺陷對(duì)腫瘤組織中自噬信號(hào)、凋亡相關(guān)信號(hào)通路、Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2

18、等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:基因缺陷小鼠生長(zhǎng)至4月齡時(shí)，解剖發(fā)現(xiàn)，ApcMin/+ATG5+/+小鼠與ApcMin/+ATG5+/-小鼠相比，腸道腺瘤的大小和數(shù)目無(wú)明顯差異(P＞0.05);小鼠生長(zhǎng)至6月齡時(shí)，解剖發(fā)現(xiàn)，與ApcMin/+ATG5+/+小鼠相比，ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的數(shù)目有所增加，達(dá)到顯著性差異。組織病理學(xué)結(jié)果表明，雜合性ATG5缺陷不足以引起ApcMin/+小鼠的腸道腺瘤發(fā)

19、生癌變，對(duì)腸道腺瘤的惡性程度無(wú)顯著影響。Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雜合性ATG5缺陷對(duì)腸道腫瘤細(xì)胞凋亡及自噬通路無(wú)顯著影響，但激活了腫瘤相關(guān)的Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2信號(hào)通路，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:雜合性ATG5缺陷可以促進(jìn)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的生長(zhǎng)，但不足以引起ApcMin/+小鼠腸道腺瘤發(fā)生癌變。ATG5缺陷對(duì)腸道腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能與對(duì)Wnt/β-catenin

20、和EGFR/Erk1/2等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的促進(jìn)作用有關(guān)，而與細(xì)胞的自噬和凋亡作用無(wú)關(guān)。
　　第二節(jié) ATG5基因缺失對(duì)APC突變背景的結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29生長(zhǎng)的影響（體外實(shí)驗(yàn)）
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?確定ATG5基因缺失對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:使用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染ATG5-target siRNA，下調(diào)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中的ATG5基因水平;western blotting法檢測(cè)

21、ATG5蛋白的表達(dá)水平，確定ATG5基因的沉默效率。通過(guò)MTT法檢測(cè)沉默ATG5對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響;通過(guò)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATG5沉默對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:使用ATG5-target siRNA，通過(guò)lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞，western blotting試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA可以顯著降低ATG5的蛋白水平，沉默效率達(dá)90％以上。MTT法檢

22、測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATG5沉默后HT-29細(xì)胞的增殖被顯著抑制。細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)得出相同的結(jié)論，即與沉默無(wú)關(guān)序列相比，沉默ATG5之后HT-29細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:ATG5沉默可以顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖，并且顯著抑制了HT-29細(xì)胞的克隆形成。我們推測(cè)，ATG5缺失方式的不同以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬的差異等原因可能是造成體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的因素。
　　第三節(jié) ATG5基因缺陷顯著提高IFN-γ對(duì)ApcMin

23、/+小鼠腸道腫瘤的抑制作用
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證ATG5基因缺陷可以提高抗腫瘤藥物的藥效作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:使用腸道腺瘤ApcMin/+小鼠模型和雜合性ATG5缺陷的ATG5+/-小鼠模型，通過(guò)雜交繁育和基因鑒定等方法得到子代ApcMin/+ATG5+/-和ApcMin/+ATG5+/-小鼠模型。采用腹腔注射鼠源IFN-γ的方法，比較IFN-γ早期預(yù)防給藥以及晚期治療給藥前后ApcMin/+ATG5+/+與Ap

24、cMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤大小、數(shù)目的變化，通過(guò)組織病理學(xué)檢驗(yàn)分析給藥前后小鼠腸道腫瘤惡性程度的變化，確定雜合性ATG5缺陷對(duì)IFN-γ療效的影響，進(jìn)一步確定ATG5基因缺陷是否可以提高IFN-γ對(duì)ApcMin/+小鼠腸道腫瘤的抑制作用。通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行攝食量、體重及血常規(guī)檢測(cè)，分析IFN-γ給藥所引起的毒性反應(yīng)。通過(guò)western blotting分析，檢測(cè)ATG5缺陷對(duì)IFN-γ誘導(dǎo)的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-caten

25、in和EGFR/Erk1/2的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:早期IFN-γ預(yù)防給藥于腸道腫瘤尚未出現(xiàn)時(shí)開(kāi)始，給藥3個(gè)月，中間休息一個(gè)月，晚期IFN-γ治療給藥于腫瘤出現(xiàn)之后開(kāi)始，給藥方式相同。給藥結(jié)束后解剖發(fā)現(xiàn)，早期IFN-γ預(yù)防給藥后，ApcMin/+ATG5+/-小鼠腸道腺瘤的數(shù)目與陰性對(duì)照組（給予生理鹽水）的ApcMin/+ATG5+/-小鼠相比明顯減少，下降了95.5％，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，給藥后，ApcMin/+ATG5+/-小鼠的

26、腸道腺瘤極少，大多數(shù)部位僅見(jiàn)增生。而ApcMin/+ATG5+/+小鼠早期給藥IFN-γ后，腸道腺瘤數(shù)目較陰性對(duì)照組的ApcMin/+ATG5+/+小鼠雖有所減少，下降了43.3％，但仍見(jiàn)數(shù)目較多的腸道腺瘤以及較為嚴(yán)重的發(fā)育不良等病理學(xué)特征。因此，ATG5缺陷可大大提高IFN-γ早期預(yù)防給藥的效果。此外，ATG5缺陷還可提高晚期IFN-γ給藥的藥效，但提高的幅度較早期給藥小。鑒于早期IFN-γ給藥出現(xiàn)的良好的腺瘤抑制效果，我們進(jìn)一步檢測(cè)

27、了IFN-γ給藥的毒性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ給藥對(duì)小鼠攝食量和體重?zé)o明顯影響;血常規(guī)結(jié)果表明，IFN-γ給藥后不僅未出現(xiàn)白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞的減少，反而出現(xiàn)血小板的略微上升，因此IFN-γ給藥可能有助于提高小鼠的自身免疫水平。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)，ATG5缺陷提高了IFN-γ對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路Wnt/β-catenin和EGFR/Erk1/2的抑制作用，進(jìn)而提高了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:AT