馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)基因分析.pdf

1、目的先天性馬蹄內(nèi)翻足(congenitaltalipesequinovarus，CTEV；congenitalclubfoot，CCF)是一種兒童常見(jiàn)的嚴(yán)重影響足功能的先天畸形，發(fā)病率約為0.064～0.8％，男女之比約為2.0～2.5∶1，在活產(chǎn)胎兒中發(fā)生率約為1‰，雙側(cè)同時(shí)發(fā)病占50％，右足多于左足。主要畸形包括前足內(nèi)收、踝跖屈、跟骨內(nèi)翻以及繼發(fā)性脛骨遠(yuǎn)端內(nèi)旋?；尾挥绊懟純荷婧蜕?，但嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。病因目前還不清楚，有多種

2、學(xué)說(shuō)，如：神經(jīng)肌肉病變，血管發(fā)育異常，骨骼發(fā)育異常，軟組織異常，遺傳基因?qū)W說(shuō)以及宮內(nèi)發(fā)育阻滯學(xué)說(shuō)等。部分學(xué)者在某一領(lǐng)域達(dá)成共識(shí)，如：神經(jīng)肌肉病變學(xué)說(shuō)，但尚無(wú)定論。遺傳流行病學(xué)研究表明，遺傳因素是馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病主要原因之一。 蛋白質(zhì)廣泛參與細(xì)胞的功能及調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)組決定細(xì)胞乃至組織和器官的表型。不論是處于正常狀態(tài)還是急慢性疾病狀態(tài)，表型都是多種多樣的。蛋白質(zhì)組學(xué)是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，其核心在于大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析，通過(guò)對(duì)某

3、物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)性質(zhì)(包括表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)相互作用等)的研究，對(duì)蛋白質(zhì)所執(zhí)行的生理性、病理性生命活動(dòng)做出最精細(xì)、最準(zhǔn)確、最本質(zhì)的闡述。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)是現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)組學(xué)研究模式。該策略的技術(shù)路線主要是通過(guò)雙向凝膠電泳建立蛋白質(zhì)組圖譜、用專(zhuān)業(yè)圖像掃描分析軟件進(jìn)行圖像分析、通過(guò)質(zhì)譜及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)信息處理技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定與分析。 本實(shí)驗(yàn)在全反式維甲酸(alltrans-

4、retinoicacid，ATRA)誘導(dǎo)大鼠動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用雙向電泳的方法對(duì)脊髓組織蛋白質(zhì)組進(jìn)行分離，通過(guò)軟件分析和質(zhì)譜-生物信息學(xué)方法尋找疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，通過(guò)該蛋白質(zhì)進(jìn)一步尋找馬蹄內(nèi)翻足疾病相關(guān)基因。 前期通過(guò)對(duì)胎鼠脛骨后肌組織的蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)慢骨骼肌肌鈣蛋白T(slowskeletalmuscletroponinT，sTnT；troponinT，slowskele-talmuscle，TnTs)在模型胎鼠中

5、未見(jiàn)表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法，進(jìn)一步分析該蛋白的編碼基因—Tnnt1—與馬蹄內(nèi)翻足疾病發(fā)生的關(guān)系。 方法1.建立馬蹄內(nèi)翻足大鼠胚胎模型 1.1將孕10d的Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按135mg/kg體重用灌胃法給予實(shí)驗(yàn)組大鼠ATRA，對(duì)照組給予相應(yīng)體積礦物油。 1.2孕21d剖腹取出胚胎，分離脊髓、踝部骨骼(下肢踝關(guān)節(jié)上2mm至足正中，去除肌肉、皮膚組織)及踝部肌肉(下肢踝關(guān)節(jié)上2mm至足正

6、中，去除骨骼、皮膚組織)。 2.模型胎鼠與對(duì)照胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)組差異分析 2.1提取胎鼠脊髓組織的總蛋白質(zhì)，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。 2.2等電聚焦使用PROTEANIEF等電聚焦儀。聚焦后的膠條經(jīng)兩步平衡后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，染色、掃描后用PDQuest7.1.0進(jìn)行圖像分析，尋找差異蛋白點(diǎn)。 2.3切取差異點(diǎn)并進(jìn)行質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析。 3.Tnnt1在模型胎鼠和對(duì)照胎鼠中表達(dá)

7、情況分析 3.1用TRIzol試劑分別提取模型胎鼠和對(duì)照胎鼠的脊髓、踝部骨骼和踝部肌肉的總mRNA。 3.2用RT-PCR方法檢測(cè)該基因在三種組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析Tnnt1與馬蹄內(nèi)翻足畸形的相關(guān)性。 結(jié)果1.成功重復(fù)構(gòu)建了馬蹄內(nèi)翻足樣畸形大鼠模型 孕21d剖檢共獲取胎鼠344只，其中對(duì)照組112只，實(shí)驗(yàn)組232只。對(duì)照組CCF樣畸形發(fā)生率為零；實(shí)驗(yàn)組CCF樣畸形發(fā)生率為80.98％，其中單純CCF

8、發(fā)生率達(dá)29.27％。 2.模型胎鼠和對(duì)照胎鼠脊髓組織雙向電泳圖譜差異分析結(jié)果 使用寬pH(pH3-10)膠條和窄pH(pH5-8)膠條所獲圖譜均顯示多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配良好。在兩種圖譜中：模型胎鼠中分別有13～15和8～10個(gè)蛋白點(diǎn)明顯上調(diào)，15～17和10～12個(gè)蛋白點(diǎn)明顯下調(diào)，有9～11和11～13個(gè)蛋白點(diǎn)僅在對(duì)照胎鼠中表達(dá)，7～9和10～13個(gè)蛋白點(diǎn)僅在模型胎鼠中表達(dá)。 3.模型胎鼠和對(duì)照胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)組

9、分析結(jié)果 選取界限清楚、重復(fù)性好的6個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。6個(gè)點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果均為陽(yáng)性。經(jīng)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，檢索結(jié)果陰性者1個(gè)，檢索結(jié)果陽(yáng)性者5個(gè)(其中2個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)結(jié)果一致)，初步鑒定的結(jié)果分別為：烯醇酶(僅表達(dá)于對(duì)照胎鼠)、ATP合酶F1復(fù)合體組裝因子2(僅表達(dá)于模型胎鼠)、微管蛋白β鏈(模型胎鼠下調(diào)5倍以上)和載脂蛋白A-Ⅰ(模型胎鼠上調(diào)5倍以上)。 4.Tnnt1基因在馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠中的表達(dá)

10、 半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，70.0％(21/30)的馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠踝部骨骼和76.7％(23/30)的踝部肌肉組織中Tnnt1表達(dá)下調(diào)，在脊髓組織中基本無(wú)表達(dá)。 結(jié)論1.首次應(yīng)用雙向電泳技術(shù)獲得了重復(fù)性好的孕21d胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜。 2.首次分析了馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠與對(duì)照胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)組差異，模型胎鼠的烯醇酶沒(méi)有表達(dá)，微管蛋白表達(dá)下調(diào)，載脂蛋白表達(dá)上調(diào)，而ATP合酶F1復(fù)合體組裝因子2僅在