在位內(nèi)膜生物學(xué)特性及候選基因RASSF2甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥惡變中的作用.pdf

1、目的:
　　子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs，簡稱內(nèi)異癥)是普通婦科領(lǐng)域最受關(guān)注的疾病，雖然內(nèi)異癥以生育年齡女性為高發(fā)人群，而且不孕、疼痛、盆腔包塊為主要臨床特點(diǎn)，但內(nèi)異癥惡變始終是內(nèi)異癥研究的熱點(diǎn)問題。內(nèi)異癥惡變率為0.7％～1.5％[1]。近年，內(nèi)異癥的發(fā)生率不斷增高，其惡變的病例數(shù)也在逐年增加。內(nèi)異癥惡變最多見于卵巢，占內(nèi)異癥惡變的76％，主要病理類型為內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌。卵巢外的內(nèi)異癥惡變可見于腸道、盆

2、腔、陰道直腸膈、陰道及剖宮產(chǎn)瘢痕等處，病理類型以異位腺上皮細(xì)胞惡變?yōu)橄侔橹鱗2]。
　　子宮內(nèi)膜異位癥惡變系統(tǒng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)研究條件成為阻礙研究進(jìn)展的重要因素，細(xì)胞模型建立、動(dòng)物模型建立報(bào)道都較罕見。轉(zhuǎn)基因誘發(fā)的靶向動(dòng)物模型最具備研究價(jià)值，但前提是疾病的致病靶基因相對明確，內(nèi)異癥惡變靶基因研究尚為空白。而內(nèi)異癥惡變移植動(dòng)物模型的建立因大樣本惡變標(biāo)本及細(xì)胞模型的缺乏而難以實(shí)現(xiàn)，誘導(dǎo)內(nèi)異癥移植動(dòng)物模型惡變存在異種排斥等干擾因素，結(jié)論

3、科學(xué)性受到質(zhì)疑。有效的誘導(dǎo)內(nèi)異癥惡變也許是突破研究障礙的重要途徑之一。
　　在內(nèi)異癥惡變臨床高危因素中，高雌激素居首，局部高雌激素刺激導(dǎo)致內(nèi)異癥異位內(nèi)膜過度生長，可能與內(nèi)異癥惡變相關(guān)[3,4]。此外，糖尿病與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[5]。高血糖為快速增殖的癌細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)環(huán)境，使其比正常細(xì)胞具有更強(qiáng)的代謝和消耗葡萄糖的能力[6]，間接促進(jìn)高雌激素對異位內(nèi)膜細(xì)胞的刺激作用。因此，高血糖可能成為內(nèi)異癥惡變的“催

4、化劑”，加速良性異位內(nèi)膜細(xì)胞惡變。手術(shù)誘導(dǎo)的大鼠自體內(nèi)異癥模型廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究[7]。大鼠異位種植內(nèi)膜與人類內(nèi)異癥有很多相似之處:異位內(nèi)膜生長方式，雌激素敏感性，病灶及腹腔液中異常細(xì)胞因子表達(dá)，以及臨床表現(xiàn)，例如:不孕[8]和盆腔疼痛等[9]。因此，大鼠內(nèi)異癥自體模型適合作為誘導(dǎo)內(nèi)異癥惡變載體。
　　內(nèi)異癥惡變的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的過程。近年來表觀遺傳學(xué)機(jī)制與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系是廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)，其中DNA

5、甲基化是表觀遺傳學(xué)上研究最深入的一種機(jī)制。DNA甲基化是指額外的甲基通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)，鏈接到CpG島中胞嘧啶5＇碳末端，CpG島發(fā)生異常甲基化常見于基因啟動(dòng)子區(qū)域[10]?；騿?dòng)子區(qū)域甲基化是導(dǎo)致基因沉默的一種重要表觀遺傳機(jī)制[10,11]，能夠通過抑制基因表達(dá)進(jìn)而使調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞粘附和解毒等相關(guān)的細(xì)胞通路失活，使細(xì)胞無限增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12，13]。RASSF2基因是本課題組通過甲基化CpG島

6、富集結(jié)合代表性差異分析(MCA-RDA)技術(shù)篩查出的卵巢內(nèi)異癥惡變組織相對正常卵巢組織的差異甲基化基因。RASSF2基因包含11個(gè)外顯子，定位于染色體20p13，跨度約43kb，具有3個(gè)轉(zhuǎn)錄本:RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C，僅RASSF2A在轉(zhuǎn)錄起始部位-105bp到+1075bp間具有一個(gè)CpG島結(jié)構(gòu)。RASSF2蛋白并不具有酶活性或者DNA結(jié)合能力，但可以通過與其他凋亡前因子及腫瘤抑制因子相互作用激活，如:PAR-

7、4和MST1/2[14,15]。因此，RASSF2同時(shí)也可調(diào)節(jié)這些因子所控制的信號通路。研究表明，RASSF2基因過表達(dá)可促進(jìn)凋亡及細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞生長[16]。相反，RASSF2表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞過度生長、惡變及腫瘤轉(zhuǎn)移[17-19]。因此，RASSF2基因被認(rèn)為是一種抑癌基因。RASSF2甲基化見于多種類型腫瘤[20,21]。本課題組前期研究表明RASSF2基因的表觀失活與卵巢內(nèi)異癥惡變相關(guān)，參與了異位內(nèi)膜向卵巢癌的惡變過

8、程，可能是內(nèi)異癥惡變過程的晚期事件[22]。因此，RASSF2基因過甲基化與內(nèi)異癥惡變的更深入機(jī)制值得探討。
　　本研究在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，通過甲基化寡核苷酸技術(shù)靶向誘導(dǎo)內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中RASSF2基因甲基化，研究RASSF2基因甲基化對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的影響。利用技術(shù)成熟的大鼠內(nèi)異癥自體模型，通過鏈脲霉素與高糖高脂飲食共同誘導(dǎo)發(fā)生糖尿病，并給予高雌激素刺激，誘導(dǎo)大鼠內(nèi)異癥惡變，進(jìn)一步明確RASSF2基因與內(nèi)異癥惡

9、變相關(guān)性。
　　方法:
　　一、高雌激素和高血糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)異癥自體模型惡變及其生物學(xué)特征研究
　　1、建立大鼠腹膜子宮內(nèi)膜異位癥模型;
　　2、高糖高脂飲食、鏈脲霉素及高雌激素誘導(dǎo)大鼠內(nèi)異癥惡變;
　　3、光鏡，電鏡觀察異位內(nèi)膜組織顯微及亞顯微結(jié)構(gòu);
　　4、免疫組化檢測大鼠異位及在位內(nèi)膜組織中PTEN、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)情況;
　　5、增殖、凋亡檢測異位組織生物活性。
　　二

10、、在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞RASSF2基因甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥惡變中的作用及意義
　　1、原代培養(yǎng)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞;
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞;
　　3、建立RASSF2甲基化(methylated oligonucleotide，MON)及非甲基化(non-methylated oligonucleotide，NON)細(xì)胞模型;
　　4、甲基化特異性PCR(Methylation Specif

11、ic PCR，MSP)技術(shù)檢測RASSF2在細(xì)胞模型中的甲基化情況;
　　5、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測RASSF2蛋白表達(dá)情況;
　　6、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染MON及NON后各組細(xì)胞增殖能力的改變;
　　7、應(yīng)用Annexin V-APC/7-AAD凋亡檢測試劑盒檢測RASSF2基因發(fā)生甲基化前后各組細(xì)胞凋亡率的改變;
　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測RASSF2基

12、因發(fā)生甲基化前后MMP-9，VEGF在培養(yǎng)上清中的含量變化;
　　9、高雌激素及高血糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)異癥惡變;
　　10、甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)技術(shù)檢測RASSF2在異位及在位組織中的甲基化情況;
　　11、蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測RASSF2在異位及在位組織中的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　一、高雌激素和高血糖誘導(dǎo)大鼠內(nèi)

13、異癥自體模型惡變及其生物學(xué)特征研究
　　1、90只實(shí)驗(yàn)大鼠中有10只于術(shù)后死亡，占11.1％。實(shí)驗(yàn)組與對照組異位病灶全部形成;
　　2、實(shí)驗(yàn)組多數(shù)異位病灶隨時(shí)間延長逐漸增大，而對照組病灶萎縮情況隨時(shí)間延長明顯增加。實(shí)驗(yàn)組在2、4、8個(gè)月異位病灶平均凈重及平均體積明顯高于相應(yīng)月份對照組異位病灶(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組中，可見2例明顯增大的異位病灶，囊壁增厚，內(nèi)壁可見乳頭樣增生。其余異位病灶呈現(xiàn)囊性，伴有囊壁不同程度增厚，囊液不

14、同程度渾濁，可見血性或膿性囊液;
　　3、光鏡下，實(shí)驗(yàn)組中，2例明顯增生的異位病灶表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜樣癌，其對應(yīng)在位內(nèi)膜組織均為不典型增生改變(4.0％);3例異位病灶不典型性增生，對應(yīng)在位內(nèi)膜組織均為單純增生樣改變(6.0％)。透射電鏡可見:惡變細(xì)胞呈現(xiàn)明顯細(xì)胞形態(tài)的異常，可見線粒體腫脹及空泡樣改變。此外，與4個(gè)月單純性增生相比，8個(gè)月單純性增生異位內(nèi)膜細(xì)胞呈現(xiàn)增大的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)減少，表現(xiàn)出更活躍的細(xì)胞狀態(tài);
　　4、在惡變

15、、不典型性增生在位及異位內(nèi)膜中，與對照組異位內(nèi)膜相比，p-AKT及p-mTOR染色H-score值逐漸增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05); PTEN染色H-score值逐漸降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。相同病理類型內(nèi)膜組織上述基因無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);
　　5、增殖實(shí)驗(yàn)顯示:實(shí)驗(yàn)組中，與良性和不典型增生異位內(nèi)膜相比，惡變的異位內(nèi)膜增殖染色H-score值明顯增加(p＜0.05);凋亡實(shí)驗(yàn)顯示:與良性和不典型增生異位內(nèi)

16、膜相比，惡變的異位內(nèi)膜凋亡染色H-score值明顯減少(p＜0.05)。雌激素組良性異位內(nèi)膜組織增殖染色H-score值高于對照組良性異位內(nèi)膜組織(p＜0.05);凋亡染色強(qiáng)度低于對照組良性異位內(nèi)膜組織(p＜0.05)。
　　二、誘導(dǎo)在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞中RASSF2基因甲基化及其分子生物學(xué)研究
　　1、體外成功分離和共培養(yǎng)子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞(EC);
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果表明，角蛋白染色陽性

17、，CD10染色陰性，波形蛋白染色陰性，證實(shí)為子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞;角蛋白染色陰性，CD10染色陽性，波形蛋白染色陽性，證實(shí)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞;
　　3、構(gòu)建兩個(gè)甲基化細(xì)胞模型（MON1組及MON2組），一個(gè)非甲基化細(xì)胞模型(NON組)，未轉(zhuǎn)染寡核苷酸的對照組（EC組）;
　　4、MSP結(jié)果顯示:MON1組及MON2組內(nèi)膜細(xì)胞均發(fā)生RASSF2基因甲基化，NON組未檢測到該基因發(fā)生甲基化;
　　5、蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:MO

18、N1組及MON2組RASSF2蛋白表達(dá)水平均低于NON組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。MON1組及MON2組RASSF2蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，NON組及EC組無差異(p＞0.05);
　　6、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MON1組及MON2組在24h，48h和72h細(xì)胞增殖能力明顯高于相應(yīng)NON組(p＜0.05)。其中，MON1及MON2組在72hEC增殖能力低于48h(p＜0.05)。NON組細(xì)胞增殖能力與

19、EC組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);
　　7、凋亡檢測結(jié)果顯示:RASSF2發(fā)生甲基化后EC即轉(zhuǎn)染MON1及MON2后凋亡率明顯降低，與RASSF2未發(fā)生甲基化的NON組比較，p＜0.05。EC轉(zhuǎn)染NON組細(xì)胞凋亡率與EC組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(p＞0.05);
　　8、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染MON1后，EC分泌VEGF及MMP-9較轉(zhuǎn)染NON組明顯增加(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染MON2后，EC分泌VEGF及MM

20、P-9較轉(zhuǎn)染NON組明顯增加(p＜0.05)。但MON1組及MON2組，EC分泌上述兩種蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。轉(zhuǎn)染NON組，EC分泌VEGF及MMP-9與EC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　9、MSP檢測結(jié)果表明:惡變及不典型性增生異位內(nèi)膜中RASSF2甲基化發(fā)生率高于良性異位內(nèi)膜(p＜0.05)，惡變異位內(nèi)膜中該基因的甲基化發(fā)生率高于不典型性增生異位內(nèi)膜(p＜0.05)。異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜RASSF2甲基化

21、率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　10、Western blot結(jié)果顯示:惡變異位內(nèi)膜和不典型性增生異位內(nèi)膜RASSF2蛋白相對表達(dá)水平分別為低于對照組異位內(nèi)膜(p＜0.05)，惡變異位內(nèi)膜RASSF2蛋白相對表達(dá)水平低于不典型性增生異位內(nèi)膜(p＜0.05)。相同病理類型在位及異位組織RASSF2蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究誘導(dǎo)大鼠內(nèi)異癥惡變可模擬人類低級別子宮內(nèi)膜樣腺癌，

22、方法簡單可行，并為進(jìn)一步探討內(nèi)異癥惡變動(dòng)物模型的建立，乃至為內(nèi)異癥惡變基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜對誘導(dǎo)因素具有相似反應(yīng)，發(fā)生一致性病理異常增值改變，其中異位內(nèi)膜更敏感、具有更高的惡變風(fēng)險(xiǎn)，提示在位內(nèi)膜惡變與異位內(nèi)膜惡變可能存在相似的遺傳相關(guān)性。
　　2、通過甲基化寡核苷酸技術(shù)特異性誘導(dǎo)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞RASSF2基因甲基化，抑制該基因表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)，并抑制細(xì)胞凋亡，RASSF2基因甲基化可