Ⅱ型膠原自身抗體檢測(cè)方法學(xué)建立及對(duì)自身免疫性關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).pdf

1、目的：從創(chuàng)傷性截肢患者術(shù)中切下的膝關(guān)節(jié)軟骨中用蛋白酶消化和酸溶解的方法提取人可溶性Ⅱ型膠原,采用人Ⅱ型膠原作為固相抗原,建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)Ⅱ型膠原自身抗體的方法.對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA) 、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus,SLE)、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者和正常對(duì)照組血清中Ⅱ型膠原自身抗體進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行

2、評(píng)價(jià). 方法：1.從創(chuàng)傷性截肢患者術(shù)中切下的膝關(guān)節(jié)軟骨中提取并純化Ⅱ型膠原,并用SDS-PAGE法和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)所得Ⅱ型膠原純度和抗原屬性等進(jìn)行鑒定.2.利用人Ⅱ型膠原為抗原更具有同源性,同時(shí)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立Ⅱ型膠原自身抗體的間接ELISA法.并對(duì)本方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),包括特異度和精密度等指標(biāo).3.收集類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和骨關(guān)節(jié)炎患者,以及健康體檢人群的血清標(biāo)本,檢測(cè)Ⅱ型膠原自身抗體的含量并進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).

3、 結(jié)果：1.從創(chuàng)傷性截肢患者膝關(guān)節(jié)軟骨中提取的Ⅱ型膠原與雞Ⅱ型膠原純品的抗原性和分子量均相同,雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果顯示,在提取液和雞Ⅱ型膠原純品抗原與鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體孔之間形成一端相互融合成弧形乳白色沉淀線;SDS-PAGE結(jié)果可見(jiàn)在蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物97.4KD處附近出現(xiàn)單一條帶,與雞Ⅱ型膠原純品電泳條帶位置相符.成功建立了間接ELISA法檢測(cè)Ⅱ型膠原自身抗體,該方法具有良好的精密度,其批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV﹪值)分

4、別為6.48﹪、9.38﹪和16.63﹪、13.04﹪.通過(guò)羊血清的應(yīng)用和運(yùn)用棋盤(pán)滴定法確定最佳工作濃度等方法來(lái)優(yōu)化反應(yīng)條件,提高檢測(cè)靈敏度和特異性,抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著加入的Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加,OD值逐漸降低,兩份樣本的抑制率分別為16.41﹪、23.44﹪、36.72﹪和15.22﹪、32.61﹪、41.30﹪,說(shuō)明試驗(yàn)具有較好的特異性. 2.33例RA患者和109例SLE患者血清Ⅱ型膠原自身抗體的含量均顯著升高,檢測(cè)OD值

5、的95﹪可信區(qū)間分別為0.31～0.61和0.46～0.59,與60例正常對(duì)照組(0D值的95﹪可信區(qū)間為0.20～0.27)比較有顯著性差異(P均<0.01);而33例OA患者組血清Ⅱ型膠原自身抗體的含量(0D值的95﹪可信區(qū)間為0.06～0.10)顯著低于正常對(duì)照組、RA患者組和SLE患者組(P均<0.01);RA患者組和SLE患者組血清Ⅱ型膠原自身抗體的含量無(wú)顯著性差異(P>0.05).經(jīng)ROC曲線分析,得用血清Ⅱ型膠原自身抗體診

6、斷自身免疫性關(guān)節(jié)炎的ROC曲線下面積(AUC-ROC)為0.794(95﹪CI:0.134～0.854),OD值0.27為臨界值時(shí),靈敏度為69.0﹪、特異度為66.7﹪、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.5﹪和陰性預(yù)測(cè)值為43.0﹪.經(jīng)相關(guān)性分析,RA患者血清Ⅱ型膠原自身抗體與目前臨床常用的RA活動(dòng)性指標(biāo)CRP、RF、ESR和CCP抗體及臨床病情程度均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05);SLE患者血清Ⅱ型膠原自身抗體與SLE活動(dòng)性指標(biāo)ANA和抗ds-DNA

7、抗體陽(yáng)性率辦無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05). 結(jié)論：1.采用人可溶性Ⅱ型膠原作為固相抗原檢測(cè)血清Ⅱ型膠原自身抗體水平的ELISA間接法具有敏感、特異、重復(fù)好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),為Ⅱ型膠原自身抗體臨床應(yīng)用創(chuàng)造了檢測(cè)條件.2.自身免疫性關(guān)節(jié)炎患者血清中Ⅱ型膠原自身抗體水平的顯著變化,為Ⅱ型膠原自身抗體作為自身免疫性關(guān)節(jié)炎的診斷指標(biāo)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).3.血清Ⅱ型膠原自身抗體水平與RA和SLE患者病情活動(dòng)性指標(biāo)不相關(guān),血清Ⅱ型膠原自