硝克柳胺防治糖尿病并發(fā)癥作用機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病慢性并發(fā)癥，是糖尿病致死致殘的主要原因。糖代謝異常導(dǎo)致血管、神經(jīng)以及組織器官的損傷。微血管并發(fā)癥有糖尿病眼病、糖尿病腎病等；大血管并發(fā)癥有冠心病、腦中風(fēng)、糖尿病壞疽等；糖尿病神經(jīng)并發(fā)癥包括感覺(jué)神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及植物神經(jīng)異常等。糖尿病并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制有醛糖還原酶活性增強(qiáng)、糖基化終末產(chǎn)物(AGE)形成增多、PKC活性增加以及氧化應(yīng)激。硝克柳胺是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研究開(kāi)發(fā)的1.1類(lèi)化學(xué)藥品，己申請(qǐng)中國(guó)和國(guó)際化合物發(fā)明專(zhuān)利。在大鼠

2、順鉑急性腎損傷模型、大鼠5/6腎切除模型、鏈脲霉素(STZ)致大鼠糖尿病腎病模型以及遺傳性高血壓大鼠(SHR)腎損傷模型的研究，均被證明具有明顯的腎功能保護(hù)作用。本論文在動(dòng)物體內(nèi)、分子和細(xì)胞水平，從糖尿病并發(fā)癥發(fā)病的共同機(jī)制AGE和醛糖還原酶，以及糖尿病腎病相關(guān)的致纖維化因子TGF-β1、CTGF的表達(dá)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性等方面，探討硝克柳胺防治糖尿病并發(fā)癥的作用機(jī)制，為這類(lèi)藥物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 首

3、先在大鼠STZ糖尿病模型觀察了硝克柳胺的防治糖尿病并發(fā)癥的作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、模型組、陽(yáng)性藥氯沙坦10mg/kg治療組、硝克柳胺7.5、15及30mg/kg三個(gè)劑量治療組。每周測(cè)體重、血糖，統(tǒng)計(jì)白內(nèi)障發(fā)生率。于藥物治療8、12、16及20周，測(cè)定大鼠血生化指標(biāo)及尿白蛋白。于治療20周時(shí)，處死動(dòng)物，取心臟、主動(dòng)脈及腎臟做病理學(xué)檢查，免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈及腎臟組織糖基化產(chǎn)物CML的表達(dá)，檢測(cè)腎臟致纖維化因子TGF-β1、CTGF及胞外基質(zhì)成分

4、FN及ColIV水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，硝克柳胺本身不影響血糖水平，對(duì)糖尿病大鼠的糖尿病并發(fā)癥癥狀有緩解作用。糖尿病模型組大鼠體重增長(zhǎng)較正常大鼠緩慢；硝克柳胺治療組大鼠體重較正常大鼠下降，但平均體重明顯高于模型組。糖尿病模型組大鼠在造模后6周出現(xiàn)白內(nèi)障，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(造模后20周)時(shí)白內(nèi)障發(fā)生率達(dá)80％。硝克柳胺治療組大鼠在造模后8周發(fā)生白內(nèi)障，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，30mg/kg治療組的白內(nèi)障發(fā)病率僅為37.5％，明顯低于模型組。糖

5、尿病模型組大鼠在造模后8周即出現(xiàn)高血脂癥狀，甘油三酯水平升高近1倍，膽固醇水平升高約30％；硝克柳胺治療組大鼠血中甘油三酯及膽固醇水平均低于模型組，30mg/kg治療組血脂水平接近正常。糖尿病模型組大鼠在造模后8周出現(xiàn)腎功能障礙，表現(xiàn)為血尿素氮(BUN)升高、白蛋白尿癥狀；造模后20周病理學(xué)檢查顯示，腎臟肥大、腎小球硬化、系膜區(qū)擴(kuò)張、基底膜增厚以及腎小管上皮細(xì)胞空泡變性。硝克柳胺30mg/kg治療組大鼠的腎功能指標(biāo)BUN及24hr白蛋白

6、排出量(UAE)明顯低于模型組，腎組織病理?yè)p傷程度也比模型組輕，與陽(yáng)性藥氯沙坦效果相當(dāng)。結(jié)果表明，硝克柳胺有效緩解了糖尿病大鼠的體重降低；延緩了糖尿病白內(nèi)障的發(fā)生，并且降低白內(nèi)障發(fā)生率；有效糾正了糖尿病大鼠的高血脂癥狀；對(duì)糖尿病腎臟病理?yè)p害有保護(hù)作用，明顯改善了糖尿病大鼠受損的腎功能。
　　 AGE是糖尿病慢性并發(fā)癥主要發(fā)病機(jī)制之一。AGE除了直接的損害作用，還通過(guò)與AGE受體(RAGE)相互作用，誘導(dǎo)特異的細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T

7、GF-β1、CTGF等致纖維化因子高表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠主動(dòng)脈壁和腎組織中CML-AGE水平升高，而在硝克柳胺治療組大鼠主動(dòng)脈壁和腎組織中表達(dá)較低；TGF-β1、CTGF以及胞外基質(zhì)成分FN、ColIV在模型組大鼠腎組織中表達(dá)均比正常大鼠高，硝克柳胺治療組大鼠腎組織中表達(dá)均較低。
　　 為了研究硝克柳胺的抗AGE形成與交聯(lián)作用，在體外建立了AGE形成體系，采用熒光檢測(cè)法、ELISA方法以及圓二色譜法，觀察硝克

8、柳胺的抗AGE形成作用；在體外葡萄糖和核糖介導(dǎo)的溶菌酶蛋白分子糖基化交聯(lián)體系，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)硝克柳胺的抗交聯(lián)作用。
　　 50mg/ml牛血清白蛋白及0.5mMD-葡萄糖在37℃暗處反應(yīng)一定時(shí)間，可檢測(cè)到AGE特征熒光值(Em370nm，E×440nm)，在SDS-PAGE凝膠電泳圖上可見(jiàn)到分子量增加的糖基化BSA條帶，提示50mg/ml牛血清白蛋白與0.5mMD-葡萄糖在37℃暗反應(yīng)條件下可形成BSA糖基化產(chǎn)

9、物。硝克柳胺以及硝克柳胺與BSA共孵育產(chǎn)物，對(duì)AGE的熒光檢測(cè)無(wú)干擾。在BSA-葡萄糖AGE形成體系，200μM硝克柳胺及其水溶性鉀鹽均能抑制AGE熒光值增加，對(duì)AGE非熒光產(chǎn)物CML-BSA形成也有抑制作用，與同劑量的陽(yáng)性藥氨基胍(AG)相比作用強(qiáng)度相似。BSA在圓二色譜表現(xiàn)為特異負(fù)吸收雙峰，BSA-葡萄糖糖基化產(chǎn)物在圓二色譜表現(xiàn)為特異負(fù)雙峰減弱變平坦，而水溶性硝克柳胺鉀鹽能夠抑制這種變化趨勢(shì)，與其抑制BSA糖基化有關(guān)。
　　

10、 明膠是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，核糖是還原性較強(qiáng)的五碳糖。在BSA/明膠與葡萄糖或核糖的反應(yīng)體系，BSA和明膠更容易被核糖糖基化。在體外兩種蛋白與兩種糖的AGE形成體系，硝克柳胺均明顯抑制AGE熒光值的增長(zhǎng)。
　　 在體外蛋白質(zhì)與還原糖的反應(yīng)體系中，經(jīng)過(guò)一段反應(yīng)時(shí)間，可以產(chǎn)生蛋白分子鏈間交聯(lián)，在SDS-PAGE凝膠電泳圖譜上表現(xiàn)為單分子量、2倍分子量及多倍分子量的蛋白條帶。在溶菌酶與葡萄糖及核糖反應(yīng)體系中，核糖比葡萄糖更容易介導(dǎo)蛋

11、白交聯(lián)。硝克柳胺及其鉀鹽明顯抑制了葡萄糖及核糖介導(dǎo)的溶菌酶蛋白分子間的交聯(lián)。
　　 上述結(jié)果表明，硝克柳胺及其鉀鹽對(duì)熒光AGE及非熒光AGE的形成均具有明顯的抑制作用；對(duì)糖基化蛋白交聯(lián)反應(yīng)，硝克柳胺也表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗交聯(lián)作用。
　　 多元醇通路增強(qiáng)也是糖尿病并發(fā)癥的主要發(fā)病機(jī)制之一。高血糖時(shí)，醛糖還原酶被激活造成細(xì)胞內(nèi)山梨醇大量堆積，引發(fā)一系列病理改變，從而誘發(fā)白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎臟病變等糖尿病并發(fā)癥。硝克柳胺

12、對(duì)大鼠晶狀體醛糖還原酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，IC50在0.7μM左右。
　　 為進(jìn)一步研究硝克柳胺防治糖尿病腎病的作用機(jī)制，在細(xì)胞水平觀察了AGE及高糖對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠腎系膜細(xì)胞rMC及人腎小管上皮細(xì)胞系HKC細(xì)胞周期的影響，對(duì)rMCTGF-β1及CTGF基因表達(dá)的影響以及對(duì)細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的影響。
　　 流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示，硝克柳胺本身不影響rMC及HKC的細(xì)胞周期分布。0.1mg/mlAG

13、E及25mM葡萄糖對(duì)rMC作用24hr后，細(xì)胞周期改變均表現(xiàn)為:G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞下降；硝克柳胺能干預(yù)AGE引起的rMC細(xì)胞周期改變，但幾乎不影響高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞周期變化。在HKC細(xì)胞，AGE作用24hr后細(xì)胞周期改變表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯下降；硝克柳胺能抑制AGE引起的G1期增多及S期減少。25mM葡萄糖及5ng/mlTGF-β1對(duì)HKC細(xì)胞周期的影響均為G1期阻滯，硝克柳胺未能緩解高糖及TGF-β1引

14、起的HKC細(xì)胞周期改變。
　　 AGE使rMC細(xì)胞TGF-β1及CTGF基因表達(dá)增加，分泌到細(xì)胞外液中的TGF-β1及CTGF增多。硝克柳胺對(duì)AGE誘導(dǎo)的TGF-β1及CTGF基因表達(dá)及分泌增加均有干預(yù)作用。高糖也導(dǎo)致rMC細(xì)胞分泌到細(xì)胞外液中TGF-β1及CTGF的增多，硝克柳胺對(duì)高糖誘導(dǎo)的TGF-β1及CTGF分泌增加干預(yù)作用較弱。說(shuō)明硝克柳胺通過(guò)干預(yù)AGE的作用，使過(guò)表達(dá)的TGF-β1及aGF降低，進(jìn)而抑制了AGE對(duì)細(xì)胞周

15、期的影響。
　　 AGE使rMC及HT1080分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2及MMP9的活性降低，硝克柳胺能夠部分恢復(fù)MMPs的活性。
　　 以上結(jié)果提示，硝克柳胺對(duì)AGE及高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞G1期增多、TGF-β1及CTGF高表達(dá)以及MMPs活性降低均有干預(yù)作用。
　　 綜上所述，硝克柳胺防治糖尿病并發(fā)癥的作用機(jī)制在于:抑制AGE形成，抗AGE交聯(lián)，抑制醛糖還原酶活性；硝克柳胺抗糖尿病腎病的作用機(jī)制，還與抑制AGE引

16、起的細(xì)胞周期改變、TGF-β1及CTGF高表達(dá)以及MMPs活性降低有關(guān)。
　　 順鉑為金屬鉑類(lèi)絡(luò)合物，抗癌譜廣，是臨床化療一線藥。但對(duì)腎、神經(jīng)系統(tǒng)及胰腺有毒性。最常見(jiàn)最嚴(yán)重的毒性是由于直接對(duì)腎小管的損傷作用而引起的腎功能損害，順鉑的腎毒性是其劑量限制性毒性。本實(shí)驗(yàn)室以往研究表明，硝克柳胺對(duì)順鉑所致大鼠腎功能損傷有保護(hù)作用，但對(duì)肝腎組織升高的脂質(zhì)過(guò)氧化水平無(wú)影響，體外實(shí)驗(yàn)也未觀察到抗氧化活性。提示硝克柳胺抗順鉑腎毒性作用存在其它機(jī)

17、制。
　　 順鉑的腎毒性主要是腎小管上皮細(xì)胞損傷。采用MTT方法、生長(zhǎng)曲線法及流式細(xì)胞術(shù)，觀察到順鉑抑制人腎小管上皮細(xì)胞HKC的增殖，將其阻滯在S期，對(duì)HKC有直接的毒性作用:硝克柳胺與順鉑合用時(shí)，抑制了順鉑的細(xì)胞毒作用。
　　 順鉑的抗腫瘤機(jī)制及其腎細(xì)胞毒性機(jī)制在于其與DNA堿基的結(jié)合，引起DNA交聯(lián)而改變構(gòu)象。DNA構(gòu)象的改變?cè)趫A二色譜表現(xiàn)為峰型的改變。順鉑與DNA分子中相鄰兩個(gè)堿基結(jié)合后，改變堿基相互旋轉(zhuǎn)角度，破壞

18、了堿基堆積規(guī)律，導(dǎo)致堿基間相互作用減小，使CD峰值降低，峰位紅移。當(dāng)體系中含有EDTA時(shí)，EDTA與順鉑螯合，使順鉑不能與DNA堿基結(jié)合，因此DNA的CD峰譜幾乎沒(méi)有變化。當(dāng)體系中含有0.8μM硝克柳胺，DNA、順鉑、硝克柳胺分子比為1:2:8時(shí)，硝克柳胺抑制了順鉑DNACD峰譜的改變。提示硝克柳胺可能通過(guò)螯合順鉑分子，干擾其與DNA結(jié)合而發(fā)揮作用。
　　 已知AGE形成和交聯(lián)過(guò)程都需要金屬離子參與，硝克柳胺的金屬螯合作用可能是