脂筏對(duì)tmTNF-a雙向信號(hào)影響的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、本研究分為二部分:
   第一部分:酶切位點(diǎn)缺失的跨膜型TNF-α突變體的構(gòu)建及其功能的研究
   跨膜型TNF-α(tmTNF-α)是sTNF-α的前體,分子量為26kD,主要表達(dá)在活化的單核細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面。tmTNF-α在N端比sTNF-α多76個(gè)氨基酸組成的引導(dǎo)肽,具有疏水區(qū),故可跨膜成為膜分子。表達(dá)于細(xì)胞膜表面的tmTNF-α在TNF轉(zhuǎn)化酶(TACE/ADAM17)的作用下,被剪切釋放出sTNF-α。

2、   由于tmTNF-α可被剪切成sTNF-α,為了排除sTNF-α的影響,在研究tmTNF-α生物學(xué)功能的時(shí)候需要用其酶切位點(diǎn)缺失的突變體。常用的缺失1-12位的突變體雖然基本不被TACE剪切,但是其正向信號(hào)介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)下降,反向信號(hào)傳遞缺陷,故不是一個(gè)理想的研究tmTNF-α的突變體。有報(bào)道稱△1-9,K11E突變體也不被TACE剪切,并且其胞毒效應(yīng)和野生型tmTNF-α一致,但是這種突變是否影響tmTNF-α反向信號(hào)尚不清楚。

3、
   本研究通過(guò)定點(diǎn)突變的方法,將tmTNF-α的酶切作用位點(diǎn)缺失,使得tmTNF-α不被剪切為sTNFα;并研究突變體對(duì)正反向信號(hào)的影響。主要結(jié)果如下:
   1.利用重疊PCR技術(shù),成功構(gòu)建△1-12 tmTNF-α、△1-9,K11E tmTNF-α突變體,經(jīng)酶切鑒定,PCR鑒定及測(cè)序鑒定確認(rèn)除預(yù)期突變外,無(wú)任何其它點(diǎn)突變,移碼及缺失突變。
   2.將tmTNF-α及其突變體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,經(jīng)Wes

4、tern blot鑒定wt tmTNF-α在26kD處有特異性條帶,突變體在25kD左右有特異性條帶,符合預(yù)期分子量。
   3.用野生型tmTNF-α及其突變體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,證實(shí)轉(zhuǎn)染野生型tmTNF-α的細(xì)胞能分泌大量的sTNF-α,而轉(zhuǎn)染△1-12 tmTNF-α和△1-9,K11E tmTNF-α突變體的細(xì)胞上清均未檢測(cè)到sTNF-α,提示兩個(gè)缺失突變體都喪失被TACE酶解為sTNF-α的能力。
   4.用生

5、物活性檢測(cè)證實(shí)wt tmTNF-α和△1-9,K11E tmTNF-α對(duì)靶細(xì)胞有明顯的殺傷作用;但是△1-12 tmTNF-α的胞毒效應(yīng)卻減少了近一半,說(shuō)明△1-9,K11E tmTNF-α保留了野生型tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)。
   5.用Westeill blot檢測(cè)證實(shí)△1-9,K11E tmTNF-α與wt tmTNF-α一樣能通過(guò)其反向信號(hào)有效降解IκB-α,激活NF-κB,而△1-12 tmTNF-α則失

6、去了這種能力。
   上述結(jié)果表明△1-9,K11E tmTNF-α突變體既喪失被酶解的能力,又能保留野生型tmTNF-α正向信號(hào)和反向信號(hào)傳遞能力,為進(jìn)一步研究tmTNF-α的生物學(xué)功能提供了有力的工具。
   第二部分:脂筏與tmTNF-α的正/反向信號(hào)
   脂筏是近年被發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞膜上微結(jié)構(gòu)域,區(qū)別于經(jīng)典的胞膜脂質(zhì)雙分子層,它富含膽固醇、磷脂酰肌醇。己知很多受體及其相關(guān)的信號(hào)分子均能分布在脂筏內(nèi)。由于

7、脂筏在質(zhì)膜上分布比較分散,且能側(cè)向漂移和聚集,故可形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)平臺(tái),參與活化受體募集信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,向胞內(nèi)傳遞信號(hào)。
   tmTNF-α不僅能和受體結(jié)合,向靶細(xì)胞傳遞正向信號(hào),本身還能作為受體,用其胞內(nèi)段募集信號(hào)分子,傳遞反向信號(hào)。有報(bào)道tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕櫚酰化?;稽c(diǎn),故我們推測(cè)tmTNF-α可能定位在脂筏中,但是tmTNF-α與脂筏的關(guān)系尚不清楚。此外,TNFR也能定位在脂筏,脂筏內(nèi)外的TNFR與tmTN

8、F-α之間的關(guān)系也不清楚。
   為闡明tmTNF-α與脂筏的關(guān)系,我們利用蔗糖密度梯度離心法提取脂筏結(jié)構(gòu),明確tmTNF-α的脂筏定位;并從表達(dá)tmTNF-α的效應(yīng)細(xì)胞和表達(dá)TNFR的靶細(xì)胞兩方面入手,研究脂筏在tmTNF-α正反向信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。其主要結(jié)果如下:
   1.脂筏與tmTNF-α反向信號(hào)
   1.1 tmTNF-α可定位脂筏內(nèi):利用蔗糖密度梯度離心法分離高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞的脂

9、筏結(jié)構(gòu),用Western blot檢測(cè)證實(shí)部分tmTNF-α定位在脂筏內(nèi)。用10mMMCD破壞脂筏,所有tmTNF-α均分布到脂筏外。
   1.2 脂筏內(nèi)tmTNF-α導(dǎo)致sTNF-α耐受:高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞對(duì)sTNF-α耐受,用MCD破壞脂筏后對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的敏感性明顯增加;而低表達(dá)tmTNF-α的T24細(xì)胞對(duì)sTNF-α敏感,脂筏破壞后,sTNF-α的胞毒效應(yīng)也明顯增強(qiáng)。提示定位在脂筏內(nèi)的tmTNF

10、-α可導(dǎo)致sTNF-α耐受
   1.3 破壞脂筏導(dǎo)致NF-κB活性下降:高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞經(jīng)MCD處理后,IκB-α降解明顯受到抑制;而低表達(dá)tmTNF-α的T24細(xì)胞經(jīng)MCD處理后,IκB-α水平則無(wú)明顯變化。提示破壞脂筏能使tmTNF-α反向信號(hào)減弱。
   1.4建立穩(wěn)轉(zhuǎn)完全定位在脂筏內(nèi)或外的tmTNF-α突變體的細(xì)胞株:利用重組PCR成功構(gòu)建cav-tmTNF-α和C-47A tmTNF-α突變

11、體,連同野生型tmTNF-α穩(wěn)轉(zhuǎn)T24細(xì)胞。提取脂筏分析證實(shí)cav-tmTNF-α完全定位于脂筏內(nèi),而C-47A tmTNF-α則完全定位于脂筏外。
   1.5 脂筏內(nèi)tmTNF-α誘導(dǎo)對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的耐受:用胞毒實(shí)驗(yàn)證實(shí)sTNF-α可有效殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α表達(dá)細(xì)胞,而對(duì)部分定位脂筏內(nèi)的wttmTNF-α表達(dá)細(xì)胞的胞毒效應(yīng)則明顯下降。提示只有脂筏內(nèi)的tmTNF-α才可導(dǎo)致細(xì)胞抵抗sTNF-α的

12、胞毒效應(yīng)。
   1.6 脂筏內(nèi)tmTNF-α可組成性活化NF-κB:Western blot證實(shí)部分定位脂筏內(nèi)的wttmTNF-α可組成性降解IκB-α,使NF-κB p65磷酸化;而僅在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無(wú)此作用。
   1.7 脂筏內(nèi)tmTNF-α可上調(diào)抗凋亡分子cIAP1基因表達(dá),下調(diào)促凋亡分子Bax基因表達(dá):用Real time PCR檢測(cè)證實(shí)部分定位在脂筏內(nèi)的wt tmTNF-α誘導(dǎo)cIAP1

13、基因表達(dá)明顯增加,卻明顯抑制Bax的基因轉(zhuǎn)錄;但是定位在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無(wú)明顯影響。
   1.8 CKI抑制劑D4476可增強(qiáng)脂筏內(nèi)tmTNF-α對(duì)sTNF-α的抵抗:用CKI的特異性抑制劑抑制tmTNF-α的磷酸化,增強(qiáng)反向信號(hào),結(jié)果可增強(qiáng)轉(zhuǎn)染wt tmTNF-α細(xì)胞對(duì)sTNF-α胞毒效應(yīng)的抵抗,卻對(duì)sTNF-α殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNFα
   表達(dá)細(xì)胞則無(wú)明顯作用。提示tmTNFα

14、誘導(dǎo)的sTNF-α耐受是由定位在脂筏內(nèi)的tmTNF-α通過(guò)其反向信號(hào)介導(dǎo)的。
   1.9 tmTNF-α以脂筏為平臺(tái)傳遞反向信號(hào):用可溶性TNF受體刺激tmTNF-α反向信號(hào)或轉(zhuǎn)染定位脂筏內(nèi)、外的tmTNF-α及其突變體證明激活tmTNF-α可導(dǎo)致該分子本身向脂筏內(nèi)聚集,且募集其反向信號(hào)分子TRAF1、IKK-α和NF-κBp52至脂筏內(nèi);而定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α則對(duì)這些信號(hào)分子脂筏內(nèi)外的分布無(wú)影響。提示tm

15、TNF-α可能是以脂筏為平臺(tái)傳遞反向信號(hào)的。
   2.脂筏與tmTNF-α正向信號(hào)
   2.1效應(yīng)細(xì)胞脂筏對(duì)tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的生物學(xué)功能的影響
   2.1.1 tmTNF-α胞毒效應(yīng)與其定位脂筏內(nèi)外無(wú)關(guān):用MCD破壞Raji細(xì)胞的脂筏,發(fā)現(xiàn)與TNF抗體封閉一樣,幾乎可以完全阻斷tmTNF-α對(duì)T24細(xì)胞的胞毒效應(yīng)。
   但是,轉(zhuǎn)染野生型tmTNF-α、完全定位在脂筏外的C-47A tmT

16、NF-α突變體或完全定位在脂筏內(nèi)的cav-tmTNF-α突變體的效應(yīng)細(xì)胞都具有相似的胞毒效應(yīng),三者間無(wú)明顯差異,提示效應(yīng)細(xì)胞脂筏內(nèi)外的tmTNF-α均可有效殺傷靶細(xì)胞,即tmTNF-α殺傷靶細(xì)胞與其是否定位脂筏無(wú)關(guān)。
   2.1.2 破壞ICAM-1脂筏定位抑制效靶細(xì)胞粘附,從而阻斷tmTNF-α胞毒效應(yīng):
   用MCD破壞脂筏則所有ICAM-1分布至脂筏外,效/靶細(xì)胞粘附下降,tmTNF-α
   胞毒作用

17、幾乎被完全阻斷,而ICAM-1中和抗體可部分抑制效/靶細(xì)胞之間的粘附,并部分阻斷tmTNF-α胞毒作用。提示MCD阻斷tmTNF-α胞毒效應(yīng)是由于破壞粘附分子脂筏定位,進(jìn)而抑制效/靶細(xì)胞粘附所致。
   2.1.3 破壞脂筏導(dǎo)致sTNF-α分泌增加:用MCD破壞Raji細(xì)胞的脂筏,可導(dǎo)致部分本來(lái)分布在脂筏內(nèi)的TACE轉(zhuǎn)至脂筏外,sTNF-α產(chǎn)生明顯增加。
   2.2 靶細(xì)胞脂筏對(duì)tmTNF-α正向信號(hào)介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的

18、影響
   2.2.1 tmTNF-α刺激誘導(dǎo)靶細(xì)胞TNFR1向脂筏內(nèi)聚集:用固定的高表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞作用于T24細(xì)胞,可見(jiàn)T24細(xì)胞大量TNFR1從脂筏外轉(zhuǎn)移至脂筏內(nèi),此結(jié)果提示TNFR定位在脂筏可能影響tmTNF-α的正向信號(hào)。
   2.2.2 sTNF-α及脂筏內(nèi)外的tmTNF-α對(duì)靶細(xì)胞脂筏內(nèi)外TNFR1的作用:用MCD破壞靶細(xì)胞脂筏導(dǎo)致sTNF-α胞毒效應(yīng)顯著增加,卻明顯抑制wt tmTNF-

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