TNFR1的內(nèi)化與脂筏關系的探討.pdf

1、脂筏和小窩是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域,在啟動許多信號通路中起到很重要的作用。小窩在質(zhì)膜上形如瓶頸形凹陷,是脂筏的一個子集。
　　內(nèi)化作用可在細胞內(nèi)體表面募集信號分子并激活相應的信號級聯(lián)反應來啟動信號通路。受體和配體可以通過多種途徑從細胞表面發(fā)生內(nèi)化。其中最主要的是網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)化作用,除此之外,脂筏也能介導內(nèi)化作用。
　　大量研究證實sTNF-α通過TNFR1既可以活化NF-κB,促進細胞生存,又可以誘導細胞凋亡

2、。而后者依賴于受體內(nèi)化,在胞漿形成DISC信號復合物。本室前期工作發(fā)現(xiàn),用MCD破壞Hela細胞的脂筏,可以顯著增強sTNF-α的細胞毒效應(p<0.01)。我們推測破壞脂筏可能通過促進TNFR1內(nèi)化,抑制了生存信號NF-κB的活化,促進DISC的形成,從而增強sTNF-α介導的殺傷效應。本研究主要探討脂筏與TNFR1內(nèi)化的關系,其主要結(jié)果如下:
　　一、確定MCD作用的最佳濃度
　　1.結(jié)合前期試驗和相關文獻,測定不同時間

3、點及不同濃度的MCD對細胞的胞毒效應,確定在45min時,7.5mM及以下濃度的MCD對細胞毒性小。
　　2.前期試驗證明,破壞脂筏可降低細胞的粘附能力。同質(zhì)粘附實驗證實,5mM及以上濃度的MCD能顯著降低細胞的粘附現(xiàn)象。故以下實驗采用MCD濃度為5mM,作用時間為45min。
　　二、破壞脂筏可增強sTNF-α介導的細胞殺傷和凋亡
　　1.將野生型TNFR1和內(nèi)化缺陷的突變體TNFR1-Y236A轉(zhuǎn)染293T細胞,結(jié)

4、果證實用MCD破壞脂筏,sTNF-α對轉(zhuǎn)染野生型TNFR1靶細胞的胞毒效應升高了18.7％(p<0.05),而對轉(zhuǎn)染TNFR1-Y236A細胞的胞毒效應則無明顯影響。提示MCD有可能通過影響TNFR1內(nèi)化來影響靶細胞對sTNF-α的應答。
　　2.用MCD破壞高表達TNFR1的Hela細胞的脂筏,不但可促進sTNF-α介導的胞毒效應,且可提高sTNF-α誘導的caspase-8和caspase-3的活化,提示破壞脂筏可明顯促進sT

5、NF-α介導的凋亡。
　　三、破壞脂筏減少表達在細胞表面的TNFR1
　　用MCD破壞Hela細胞的脂筏,用流式細胞術(shù)檢測sTNF-α刺激后,靶細胞表面TNFR1的表達率。結(jié)果顯示,脂筏的破壞使膜表面TNFR1的表達率下降了13.17%(p<0.05),而Western blot顯示MCD并不影響細胞內(nèi)TNFR1的總表達量。提示脂筏破壞可能促進sTNF-α介導的TNFR1內(nèi)化。
　　四、構(gòu)建定位于脂筏內(nèi)的TNFR1突變

6、體
　　正常情況下,TNFR1部分在脂筏內(nèi),部分在脂筏外。為使所有TNFR1定位在脂筏內(nèi),我們通過重迭PCR將駐留于脂筏內(nèi)的caveolin1脂筏定位結(jié)構(gòu)域(301-378)連接到TNFR1胞內(nèi)內(nèi)化結(jié)構(gòu)域(1-729)。突變體命名為TNFR1-CAV,將其連接到N1-EGFP質(zhì)粒上,并瞬轉(zhuǎn)293T細胞,其表達效率達到62.4%時,提取脂筏,通過抗TNFR1抗體和GFP抗體,均證實TNFR1-CAV-GFP融合蛋白全部定位在脂筏層中

7、。
　　五、激光共聚焦掃描顯微鏡觀察TNFR1及其幾種突變體的內(nèi)化
　　分別對293T細胞轉(zhuǎn)染標記了GFP的TNFR1,TNFR1-Y236A,TNFR1-ΔDD,TNFR1-CAV,在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)破壞脂筏可明顯促進sTNF-α誘導的野生型和缺失DD的TNFR1的內(nèi)化,但缺失內(nèi)化結(jié)構(gòu)域的TNFR1則在任何刺激下不發(fā)生內(nèi)化。有意思的是sTNF-α不能誘導所有定位于脂筏內(nèi)的TNFR1-CAV發(fā)生內(nèi)化,但用MC