高糖誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)激活TNFR1受體促內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是因遺傳和壞境因素共同作用而引起的高血糖以及碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等代謝失衡的慢性疾病。它不僅引起糖代謝紊亂，而且引起血管病變。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)在維持血管健康和促進(jìn)受損血管的重建過(guò)程中起著重要作用。當(dāng)前，在糖尿病血管新生受損的機(jī)制研究中，EPCs功能失調(diào)相關(guān)因素已經(jīng)受到廣泛重視，其中，氧化應(yīng)激與EPCs功能失調(diào)關(guān)系密切

2、。已有研究表明:糖尿病患者的高血糖環(huán)境可以使EPCs凋亡增多，數(shù)量減少，而且凋亡增加可能是糖尿病血管病變中EPCs減少的主要機(jī)制。細(xì)胞凋亡是由基因控制的一種自主性、程序性的死亡過(guò)程，它可以由多種刺激因素引起并且主要通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的途徑介導(dǎo)凋亡，在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，腫瘤壞死因子受體(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)是當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)的最大的死亡受體家族，其凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程中，主要是由TNFR1

3、介導(dǎo)的。有研究報(bào)道高糖能誘導(dǎo)EPCs中TNFR1表達(dá)，這種效應(yīng)能被抗氧化劑抑制。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)觀察體外高糖是否通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)激活TNFR1及其下游的凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)大鼠骨髓源性EPCs凋亡產(chǎn)生影響，來(lái)探討高糖對(duì)EPCs的作用和影響。
　　方法:用頸部脫臼法處死SD大鼠，將其置于75％酒精中，浸泡并消毒15 min。然后將消毒后的大鼠放置于超凈工作臺(tái)上，用動(dòng)物解剖器械分離大鼠的股骨和脛骨，分離完成后，用含1％肝素的無(wú)菌P

4、BS液沖洗骨髓腔，直到?jīng)_洗液變無(wú)色透明為止，收集好沖洗液，并用離心機(jī)進(jìn)行高速離心，離心后收集試管底部的細(xì)胞，選擇使用Ficoll密度梯度離心法進(jìn)行大鼠骨髓源性單核細(xì)胞的分離;分離后，將其接種于6孔板中，3天后進(jìn)行首次換液，以后每隔3-4天換液，連續(xù)使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并且使用激光共聚焦顯微鏡觀察鑒定經(jīng)DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色的EPCs;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)過(guò)不同含糖濃度(5.5、15、30、60 mm

5、ol/L)處理后的EPCs凋亡率，挑出最佳濃度;使用高糖（30 mmol/L）和氧化應(yīng)激拮抗劑Tempol、TNFR1受體拮抗MAB430共同作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;使用分子探針(DCFH-DA)檢測(cè)不同糖濃度處理后EPCs的活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)含量變化;使用Western blotting檢測(cè)不同糖濃度和TNFR1受體拮抗MAB430處理EPCs后，其細(xì)胞表面TNFR1受體以及由其介導(dǎo)

6、的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白(TRADD、TRAF2、RIP、NF-kBp65、Caspase3)表達(dá)的情況。
　　結(jié)果:在使用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，EPCs大部分貼壁，呈圓形，逐漸增大伸展，培養(yǎng)至7天后，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，鏡下可見(jiàn)其呈集落樣生長(zhǎng)，培養(yǎng)至14天后，觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)“鵝卵石”樣形態(tài)分布。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞可見(jiàn)經(jīng)過(guò)DiI-ac-LDL處理后陽(yáng)性的EPCs為紅色熒光，結(jié)合了FITC-UEA-1后的EPCs為綠色熒

7、光，雙染法陽(yáng)性的細(xì)胞為正在分化的EPCs，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。在高糖刺激EPCs的早期(24-48h)，高糖組與對(duì)照組之間比較，沒(méi)有明顯的凋亡增加，而隨著高糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，即高糖刺激的晚期(72-96h)，可以發(fā)現(xiàn)高糖刺激組與正常對(duì)照組比較，凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，高糖組（15mmol/L，30mmol/L，60mmol/L）與對(duì)照組進(jìn)行組內(nèi)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在同一時(shí)間點(diǎn)，將30mmol/L，60mmol/L的高

8、糖組分別與15mmol/L高糖組相比，早期沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯凋亡，而在刺激的晚期，僅發(fā)現(xiàn)60mmol/L的高糖組與15mmol/L的高糖組比較，細(xì)胞凋亡增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在分別使用抗氧化劑Tempol、TNFR1受體拮抗劑MAB430處理EPCs24h、72h后，在與高糖組（30mmol/L）分別在24h，72h比較后，發(fā)現(xiàn)早期凋亡沒(méi)有明顯變化，而在晚期(72h)后，發(fā)現(xiàn)凋亡有明顯下降，且數(shù)值具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、1)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)的早期，高糖組與對(duì)照組比較，ROS的值沒(méi)有明顯的增加，而隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，刺激的晚期(72h)，發(fā)現(xiàn)高糖組ROS增加明顯，與對(duì)照組比較，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在刺激的早期和晚期，分別用Tempol、MAB430(TNFR1受體拮抗劑)處理后，發(fā)現(xiàn)與高糖組比較，早期ROS值沒(méi)有明顯的降低，而晚期ROS值有明顯的降低，并且與高糖組比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，高糖（30mmol/l）刺激早期2

10、4h，TNFR1蛋白及其凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白（TRAF2、TRADD、RIP、Caspase3）表達(dá)沒(méi)有上調(diào)，而在刺激的72h后，相關(guān)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)將上述蛋白表達(dá)量在72h與24h進(jìn)行比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，氧化應(yīng)激拮抗劑Tempol、TNFR1受體拮抗劑MAB430在72h能夠降低上述TNF凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而隨著高糖(30mmol/l)的刺激，NF-κB

11、p65蛋白相對(duì)表達(dá)量是逐漸降低的，其蛋白表達(dá)量在72h與24h進(jìn)行比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在用Tempol、MAB430處理后，無(wú)論是早期還是晚期，與高糖組（30mmol/l）相比，其蛋白表達(dá)量是升高的，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1.高糖通過(guò)誘發(fā)內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)其凋亡，凋亡主要發(fā)生在刺激的后期，且具有濃度和時(shí)間的依賴性。2.高糖通過(guò)誘發(fā)內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激激活其TNFR1受