緩激肽B2受體信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞和心臟干細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 緩激肽抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老
　　目的:探討緩激肽抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的具體分子機(jī)制。
　　方法:檢測(cè)冠心病患者外周循環(huán)血中CD34+細(xì)胞表面B2受體的表達(dá)。ELISA法檢測(cè)冠心病患者血漿髓過(guò)氧化物酶濃度。使用300μM過(guò)氧化氫處理人臍靜脈血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并使用不同濃度的緩激肽干預(yù)細(xì)胞，β半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老程度，DCFH-DA熒光探針檢測(cè)

2、細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量。衰老相關(guān)PCR芯片以及熒光定量PCR檢測(cè)并驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)。分別使用B2受體小干擾RNA，B2受體拮抗劑，PI3K拮抗劑LY294002，EGFR拮抗劑AG1478阻斷B2受體以及下游信號(hào)通路分子，檢測(cè)信號(hào)通路阻斷劑對(duì)BK保護(hù)作用的影響。使用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)氧化氫干預(yù)前后B2受體的表達(dá)。Western blot技術(shù)檢測(cè)各信號(hào)通路分子的表達(dá)。
　　結(jié)果:冠心病患者外周循環(huán)血中CD34+

3、細(xì)胞表面B2受體表達(dá)較健康對(duì)照顯著下降，血漿髓過(guò)氧化物酶濃度顯著升高，兩者具有顯著的相關(guān)性。β半乳糖苷酶染色和DCFH-DA熒光探針顯示緩激肽可以抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老并減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基形成。衰老相關(guān)PCR芯片和熒光定量PCR結(jié)果顯示過(guò)氧化氫能夠顯著上調(diào)RB基因的表達(dá)，下調(diào)B2受體表達(dá)，而緩激肽可以顯著下調(diào)RB基因的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示緩激肽能夠上調(diào)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)下磷酸化RB，磷酸化AKT和c

4、yclin D的表達(dá)。信號(hào)通路拮抗劑和小干擾RNA阻斷緩激肽發(fā)揮抗衰老的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:緩激肽通過(guò)B2受體介導(dǎo)的PI3K和EGFR信號(hào)通路抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老。
　　第二部分 緩激肽抑制高糖誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞的衰老
　　目的:探討緩激肽抑制高糖誘導(dǎo)的心臟干細(xì)胞衰老的具體分子機(jī)制。
　　方法:體外分離培養(yǎng)C57BL/6J小鼠c-kit陽(yáng)性心臟干細(xì)胞。使用25mM D-葡萄糖處理心臟干細(xì)胞，并使用

5、不同濃度的緩激肽干預(yù)細(xì)胞，β半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老程度，DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量。分別使用B2受體小干擾RNA，B2受體拮抗劑，PI3K拮抗劑LY294002，mTOR拮抗劑Rapamycin和P53拮抗劑PFT-α阻斷B2受體以及下游信號(hào)通路分子，檢測(cè)信號(hào)通路阻斷劑對(duì)BK保護(hù)作用的影響，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物濃度和ATP濃度，并使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)D-葡萄糖干預(yù)前后B2受體的表達(dá)。Western blot技術(shù)檢

6、測(cè)各信號(hào)通路分子的表達(dá)。
　　結(jié)果:β半乳糖苷酶染色和DCFH-DA熒光探針顯示緩激肽可以抑制D-葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠心臟干細(xì)胞衰老并減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基的形成，并能降低細(xì)胞內(nèi)超氧化物濃度，促進(jìn)ATP生成。D-葡萄糖顯著下調(diào)B2受體表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示緩激肽能夠上調(diào)高糖環(huán)境下磷酸化AKT,磷酸化mTOR的表達(dá)，下調(diào)P53和P16的表達(dá)。B2受體拮抗劑，PI3K拮抗劑，mTOR拮抗劑和小干擾RNA阻斷緩激肽發(fā)揮抗衰老的保