STAT1參與tmTNF-α通過TNFR1非DD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)包括游離型TNF-α(sTNF-α)和跨膜型TNF-α(tmTNF-α)。tmTNF-α是sTNF-α的前體，以Ⅱ型膜蛋白的形式表達(dá)在活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或其他類型細(xì)胞的表面。通過TNF轉(zhuǎn)化酶(TNF-α converting enzyme, TACE)剪切為sTNF-α,釋放到胞外。TNF-α受體有兩型：TNFR1(CD120a）和TNFR2（CD

2、120b）。兩型TNF-α均可通過TNFR介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。其中sTNF-α可通過TNFR1的死亡結(jié)構(gòu)域（DD)募集TRADD, FADD和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（death-inducing signalling complex，DISC）導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一類雙功能分

3、子，既可作為轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄；也可參與胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生存、凋亡和分化中起著重要作用。
　　本室前期工作發(fā)現(xiàn)，tmTNF-α可通過TNFR1募集死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,不依賴于TNFR1的內(nèi)化及其死亡結(jié)構(gòu)域（DD)，且可通過TNFR1的非DD結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上募集 STAT1，同時，STAT1與TNFR1及TRADD均可直接結(jié)合。推測，STAT1可能作為TNFR1

4、募集TRADD的銜接分子，進(jìn)而繼續(xù)募集FADD和caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究主要探討STAT1是否參與tmTNF-α通過TNFR1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡并研究其具體機(jī)制。其主要結(jié)果如下：
　　一．STAT1促進(jìn)tmTNF-α通過TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
　　使用缺陷STAT1的細(xì)胞U3A以及轉(zhuǎn)染STAT1的U3A(U3A-STAT1)，tmTNF-α分別刺激48h,同時設(shè)立無血清對照組。以MTT檢測tmTNF-α對兩種靶細(xì)胞

5、的殺傷作用，結(jié)果表明，tmTNF-α對兩組靶細(xì)胞在均呈現(xiàn)殺傷效應(yīng)，且轉(zhuǎn)染STAT1后，這種殺傷效應(yīng)明顯升高。說明STAT1對tmTNF-α的殺傷有促進(jìn)作用。同時使用免疫共沉淀法，檢測tmTNF-α刺激30min后TNFR1能募集的凋亡信號分子，分組同上，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染STAT1后，TNFR1能募集STAT1，同時募集的DISC信號分子增多，表明STAT1促進(jìn)了tmTNF-α通過TNFR1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　二．STAT1在tmT

6、NF-α通過TNFR1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路中可作為銜接分子發(fā)揮重要作用
　　本課題組前期工作提示，STAT1可能通過與TNFR1的非死亡結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合，作為銜接分子募集DISC復(fù)合物中的TRADD等分子，進(jìn)而參與tmTNF-α通過TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為證明這一觀點(diǎn)，我們分別用帶his標(biāo)簽的空載，TNFR1及TNFR1-DD轉(zhuǎn)染U3A細(xì)胞，tmTNF-α刺激30min后，使用His抗體進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果顯示：在缺陷STAT

7、1的細(xì)胞U3A中，野生型TNFR1能夠募集DISC，而缺失死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR1-ΔDD則不能。該結(jié)果表明在缺乏DD時，STAT1在tmTNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可作為銜接分子發(fā)揮著重要的作用。
　　三．STAT1在tmTNF-α作用下被募集到細(xì)胞膜上，而在sTNF-α作用下跟隨TNFR1內(nèi)化至胞漿中
　　STAT1可作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的銜接分子，同時也是一種核轉(zhuǎn)位分子。用兩型TNF-α分別刺激轉(zhuǎn)染STAT1的U3A細(xì)胞和高表達(dá)T

8、NFR1的U937細(xì)胞，同時設(shè)立對照組和抗體封閉組。免疫熒光共聚焦結(jié)果表明，tmTNF-α作用后，STAT1未出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，而sTNF-α作用于腫瘤細(xì)胞后，STAT1可向細(xì)胞膜內(nèi)募集。為了更清楚的驗(yàn)證這個結(jié)論，兩型TNF-α刺激后，我們分別提取胞漿胞膜和胞核蛋白。Western檢測STAT1的分布。結(jié)果表明，sTNF-α刺激后，STAT1主要分布在胞漿中，而tmTNF-α刺激后，STAT1則主要分布在膜上。
　　四．STAT1參

9、與tmTNF-α對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要依賴于STAT1的727位絲氨酸的磷酸化
　　將針對STAT1兩個磷酸化位點(diǎn)的三個體變體：STAT1-701Y、STAT1-727S及STAT1-DM（雙位點(diǎn)突變）分別瞬時轉(zhuǎn)染至U3A細(xì)胞，調(diào)整轉(zhuǎn)染條件至其轉(zhuǎn)染效率趨于一致后，進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組殺傷率為23.25％，野生型的殺傷率為54.16％，轉(zhuǎn)染STAT1-701Y組的殺傷率為42.15％，STAT1-727S組殺傷率為31

10、.51％, STAT1-DM組為30.91％。雙位點(diǎn)突變的質(zhì)粒STAT1-DM與STAT1-727S組的殺傷作用幾乎回復(fù)到對照水平，STAT-701Y組的殺傷作用相對減弱。表明STAT1作為銜接分子參與tmTNF-α信號通路，需要依賴其磷酸化，且主要依賴于727位絲氨酸氨基磷酸化。
　　同時將質(zhì)粒STAT1-701Y、STAT1-727S瞬時轉(zhuǎn)染至U3A細(xì)胞，tmTNF-α刺激30min，免疫共沉淀，檢測TNFR1能募集的DISC

11、分子。結(jié)果表明，STAT1-727S轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染組相比，TNFR1所募集的TRADD、FADD這兩個DISC分子的蛋白水平?jīng)]有變化；STAT1-727S轉(zhuǎn)染組與野生型STAT1轉(zhuǎn)染組相比，TRADD、FADD募集量明顯減少。STAT1對DISC信號分子的募集依賴其磷酸化。
　　綜上所述，本研究證實(shí)STAT1可作為銜接分子，結(jié)合在TNFR1的非DD結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而募集TRADD、FADD等下游信號分子，且這種介導(dǎo)凋亡作用主要依賴于STA