人源PABPN1 RRM結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)生物學研究.pdf

1、(Ⅰ)Poly(A)幾乎存在于所有真核生物的mRNA3’端，并且影響著mRNA幾乎所有的代謝活動：轉(zhuǎn)運、翻譯和降解。目前在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)有兩種不同的Poly(A)結(jié)合蛋白，它們分別是細胞質(zhì)中的PABPC和細胞核中的PABPN1。 PABPC存在于所有的真核生物中，具有起始翻譯和調(diào)控RNA降解的功能。在其N端具備四段高度保守的RRM(亦稱為RBD)，RRM1和RRM2分別與RRM3和RRM4非常類似，前兩個RRM是主要的用于特

2、異性結(jié)合poly(A)的區(qū)域。在人PABPC(RRM1/RRM2)和oligo(A)復合物晶體結(jié)構(gòu)中，β-sheet形成的平臺結(jié)合了一個處于伸展狀態(tài)構(gòu)象的寡聚核苷酸，每個RRM大約結(jié)合了4個核苷酸。 PABPN1(曾被命名為PABP2、PAB Ⅱ)是目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯一存在于細胞核內(nèi)的poly(A)結(jié)合蛋白，它可以通過刺激poly(A)合成酶活性來促進poly(A)的合成，控制poly(A)尾巴的長度。在生理條件下，該蛋白

3、始終處于單體、二聚體和多聚體的動態(tài)平衡之中，這是其發(fā)揮功能的重要環(huán)節(jié)。PABPN1-poly(A)復合物可以形成球形顆粒和線形狀態(tài)，并且在兩者之間有動態(tài)平衡。這種動態(tài)的結(jié)構(gòu)很可能是作為一種分子標尺來決定poly(A)的長度。PABPN1酸性的N-端domain是促進poly(A)合成酶活性必不可少的，C-端的富含Arg的區(qū)域和中部的RRM共同用來結(jié)合poly(A)，但只有RRM具有特異性結(jié)合的能力。雖然PABPN1結(jié)合poly(A)的能

4、力與PABPC相當，但前者只含有一個高度保守的RRM結(jié)構(gòu)域。從一級結(jié)構(gòu)比較來看，PABPN1-RRM與目前已知結(jié)構(gòu)的RRM同源性非常低，包括PABPC的RRMs。 通過原核表達得到人PABPN1-RRM結(jié)構(gòu)域并進行晶體生長，在同一條件下(同一液滴中)同時獲得了兩種不同空間群的晶體，分別解析了它們的結(jié)構(gòu)。第一個結(jié)構(gòu)利用單波長散射方法解析了2.0 A分辨率的晶體，該晶體屬于I23空間群，晶胞參數(shù)分別為：a=b=c=92.35A，最后

5、的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子17.4％，Rfree 20.7％。第二個結(jié)構(gòu)利用分子置換方法解析了2.82 A分辨率的晶體，該晶體屬于P3<,l>空間群，晶胞參數(shù)分別為：a=b=59.34 A，c=80.60A：γ=120.00°，最后的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子22.6％，Rfree 29.0％。PABPN1-RRM具有典型的RRM的αβ-sandwich空間結(jié)構(gòu)：β1α1β2β3α2β4；面向β-sheet從左向右依次為β4β1β3β2形成了

6、一個β-sheet的平面，在其后方有兩個接近90°的α-helix。但與其他RRM比較，發(fā)現(xiàn)有兩個特點使得PABPN1 RRM有著顯著的不同：loop3的走向和二聚化作用。 (Ⅱ)5-氨基酮戊酸(ALA)是四碳合成途徑當中首要的供體，植物，藻類和一些細菌也可以通過五碳途徑從谷氨酸合成5-氨基酮戊酸。在這個途徑中一系列的酶發(fā)揮著重要的作用，谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶(GSA-AT)是這個途徑的最后一個酶。其他兩個重要的酶是谷氨酸-tR

7、NA合成酶和谷氨酸-tRNA還原酶。 從基因組文庫中克隆了GSA-AT的CDS序列，并構(gòu)建了GSA-AT-p28a質(zhì)粒。重組蛋白GSA-AT-HisTag在E．coli BL21(DE3)中表達量很高，用Ni親和柱純化后純度達到95％以上。蛋白質(zhì)在濃縮和脫鹽過程中比較穩(wěn)定，動態(tài)光散射實驗證實重組蛋白是以單體的形式存在。用懸滴氣相擴散法經(jīng)過篩選和優(yōu)化得到了GSA-AT的晶體。晶體的衍射分辨率為2.3A并完成了晶體衍射數(shù)據(jù)的收集，晶

8、體空間群為C2，晶胞參數(shù)為a=109.25A，b=55.76A，c=80.50A，a=γ=90.00°，β=132.02°。一個晶體學不對稱單位含有一個蛋白質(zhì)分子。用分子置換法已獲得結(jié)構(gòu)的初相位，最后的結(jié)構(gòu)修正參數(shù)為：R因子19.3％，Rflee 23.4％。 通過對GSA-AT三維空間結(jié)構(gòu)分析，該分子單體分別由N末端domain(約65個氨基酸形成的兩段α螺旋和三段反向的β片組成)、輔基結(jié)合區(qū)(65-320，包括一個由7段β-