小麥中與水稻白葉枯病菌Harpin蛋白基因結(jié)構(gòu)域類似序列的克隆及生物學(xué)功能研究.pdf

1、Harpin蛋白是由植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的富含甘氨酸、對熱穩(wěn)定但對蛋白酶K敏感的一類蛋白。它在非寄主植物上能夠引起過敏反應(yīng)，而且很可能是植物病原細(xì)菌的一個重要的致病因子。另外，harpin蛋白還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病蟲抗性以及提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)。 本研究中，我們將Hpa1Xoo的編碼基因hrf1的核苷酸序列進(jìn)行blastn分析時發(fā)現(xiàn)，在小麥、水稻、玉米、高梁、甘蔗、大麥和粟子7種禾本科植物的EST序列中，都含有與hrf1基因不同結(jié)構(gòu)域

2、有59％以上一致性(identity)的序列。根據(jù)序列的同源性設(shè)計引物，利用nest-PCR技術(shù)從小麥的cDNA中擴(kuò)增到它們的蛋白編碼基因TA3-13和TA50-10。將TA3-13和TA50-10克隆至pMD18-T載體，經(jīng)測序驗證無誤后，經(jīng)BamHI和NdeI雙酶切回收片段后分別克隆至pET30a(+)載體，構(gòu)建了原核表達(dá)重組體pET-TA3-13和pET-TA50-10。研究表明，表達(dá)菌株Escheria coli(BL21)/p

3、ET-TA3-13和E. coli(BL21)/ pET-TA50-10在1 mM IPTG、37℃誘導(dǎo)的條件下，SDS-PAGE分析都能夠很好地表達(dá)，且主要以可溶形式存在于細(xì)胞超聲破碎后的上清液中。 將TA3-13重新經(jīng)PCR后，在3'端添加XhoI酶切位點，克隆至pMD18-T載體，經(jīng)測序驗證無誤后，用NdeI和XhoI雙酶切回收片段后分別克隆至pET30a(+)載體，構(gòu)建了his融合表達(dá)重組體pET-TA3-13his。表

4、達(dá)菌株E. coli(BL21-AI)/pET-TA3-13his經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，融合蛋白用His-Tag鎳柱純化試劑盒進(jìn)行了純化，純化蛋白的濃度達(dá)到了3.0～3.5 mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE分析，得到了單一的具有目的片段大小的清晰條帶。 我們將所得的TA3-13和TA50-10蛋白及TA3-13his純化蛋白進(jìn)行了生物學(xué)功能研究，結(jié)果表明，TA3-13和TA50-10蛋白不能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生HR。蛋白噴施處理煙草后觀察其抗病反

5、應(yīng)，分析結(jié)果顯示，沒有明顯誘導(dǎo)HR活性的蛋白TA3-13和TA50-10依然可以誘導(dǎo)煙草抗TMV，且抗病性比hpa1Xoo效果顯著。TA50-10蛋白噴施處理煙草后觀察，在十天內(nèi)對煙草抗TMV仍有效果。純化蛋白TA3-13his也進(jìn)行了誘導(dǎo)煙草抗TMV的研究，結(jié)果顯示，它對誘導(dǎo)煙草抗TMV的效果仍然顯著。經(jīng)純化后的載體his蛋白pEThis以15μg/ml處理煙草也具有一定的誘導(dǎo)抗TMV的效果。研究測定了TA3-13和TA50-10蛋白