T細(xì)胞CD59GPI對LAT脂筏內(nèi)移位及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:構(gòu)建T細(xì)胞活化連接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表達(dá)載體，以及利用基因點(diǎn)突變技術(shù)使LAT-EGFP的棕櫚?；稽c(diǎn)突變構(gòu)建LAT-EGFP-M真核表達(dá)載體，并將兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，研究CD59在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中與LAT的相互作用，探討CD59向胞內(nèi)傳遞信號的機(jī)制。
　　 方法:從人T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞中提取總RNA，利用RT-PCR的方法擴(kuò)增LAT基因，構(gòu)建LAT-EGFP

2、真核表達(dá)載體，并利用點(diǎn)突變技術(shù)使LAT-EGFP近膜處的棕櫚酰化位點(diǎn)的絡(luò)氨酸替換為甘氨酸，構(gòu)建棕櫚酰化位點(diǎn)突變的LAT-EGFP-M真核表達(dá)載體;采用電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，雙抗交聯(lián)CD59后，熒光共聚焦顯微鏡下觀察LAT分布情況的變化;用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測抗體交聯(lián)前各組后Jurkat細(xì)胞增殖情況差別;應(yīng)用ELISA檢測各組細(xì)胞上清中IL-2的變化水平;用Western blot技術(shù)檢測抗體交聯(lián)后LAT-EGFP和LA

3、T-EGFP-M的磷酸化程度。
　　 結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、western blot技術(shù)及測序鑒定LAT-EGFP真核表達(dá)載體和LAT-EGFP-M構(gòu)建成功;抗體交聯(lián)CD59之后，LAT-EGFP-M較LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏區(qū)域，并且轉(zhuǎn)染了突變LAT-EGFP-M質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞增殖速度和IL-2分泌能力低于轉(zhuǎn)染LAT-EGFP質(zhì)粒的對照組。轉(zhuǎn)染空載體EGFP-N3及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，LAT-