GPI錨固蛋白CD59通過(guò)LAT介導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討在T系急性白血病的Jurkat細(xì)胞中，GPI錨固蛋白CD59通過(guò)接頭分子LAT介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、活化、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，研究GPI類錨固分子CD59介導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制。
　　方法：分別構(gòu)建LAT-EGFP（LAT組，LAT分子高表達(dá)）、LAT-M-EGFP（LAT-M組，LAT分子的棕櫚?；稽c(diǎn)突變）、neg-EGFP（neg組，陰性對(duì)照組）融合蛋白，以慢病毒為載體，轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中，建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株

2、。CD59單克隆抗體交聯(lián)刺激CD59分子前后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察CD59和LAT分子在細(xì)胞膜上的定位和分布情況；利用CCK8和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性和凋亡情況；通過(guò)電鏡觀察各組細(xì)胞中細(xì)胞器的變化情況；利用qRT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平檢測(cè)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：共聚焦顯微鏡下觀察到各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均在80％以上，轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。LAT組中，CD59

3、和LAT分子均表達(dá)于細(xì)胞膜上且部分 LAT分子有點(diǎn)簇狀聚集區(qū)-脂筏所在部位；CD59單克隆抗體交聯(lián)刺激后，CD59和LAT的點(diǎn)簇狀聚集區(qū)更為明顯且共同定位于脂筏。LAT-M組中，LAT分子在細(xì)胞膜上散在分布，未出現(xiàn)點(diǎn)簇狀聚集區(qū)；CD59抗體作用后無(wú)明顯變化。與陰性對(duì)照組相比，LAT組的細(xì)胞增殖活性最高且出現(xiàn)明顯的中晚期凋亡現(xiàn)象，LAT-M組細(xì)胞的增殖活性最低，中晚期凋亡率最高；CD59抗體作用后，LAT組和neg組細(xì)胞增殖活性均明顯增高

4、，neg組細(xì)胞凋亡減少，LAT組無(wú)明顯變化，LAT-M組細(xì)胞凋亡增加。在基因水平上，LAT組的表達(dá)高于neg組和LAT-M組，CD59抗體交聯(lián)刺激后，LAT組無(wú)明顯變化，neg組和LAT-M組均較刺激前有所增加。Western blot結(jié)果顯示，CD59抗體交聯(lián)后，LAT組和neg組的非磷酸化蛋白表達(dá)水平均明顯降低，LAT-M組無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：GPI錨固蛋白CD59通過(guò)跨膜接頭蛋白LAT對(duì)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮調(diào)控作用，且LA