LAT在T系白血病裸鼠CD59介導(dǎo)的T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用研究.pdf

1、目的：利用T系Jurkat白血病細(xì)胞建立裸鼠動(dòng)物模型，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，研究T細(xì)胞活化銜接蛋白（LAT）及其棕櫚?；?，在CD59分子介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)人Jurkat細(xì)胞，構(gòu)建LAT-EGFP（LAT分子高表達(dá)）、LAT-M-EGFP（LAT分子棕櫚?；稽c(diǎn)突變）的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞，從而建立穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。BALB/C純系雌性裸鼠24只，編號(hào)后隨機(jī)抽取，分為空白對(duì)照

2、組1組，以及實(shí)驗(yàn)組3組：LAT組、LAT-M組和正常Jurkat組，每組6只。第一、第二天通過(guò)腹腔注射定量的環(huán)磷酰胺，第三天用尾靜脈注射的方法，實(shí)驗(yàn)組小鼠分別接種Jurkat細(xì)胞株5×106個(gè)/只，空白對(duì)照組小鼠則尾靜脈注射等量無(wú)菌PBS溶液，注射定時(shí)定量，連續(xù)兩天。觀察小鼠發(fā)病一般體征，分別于移植后第1周（7d）、第2周（14d）、第3周（21d）、第4周（28d）監(jiān)測(cè)體質(zhì)量及外周血白細(xì)胞數(shù)量變化；并用ELISA檢測(cè)模型小鼠外周血中I

3、L-2表達(dá)水平；取肝脾組織進(jìn)行HE染色觀察；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)骨髓白血病細(xì)胞增殖率；免疫組化染色法檢測(cè)肝組織中細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平；血涂片于激光共聚焦顯微鏡下觀察CD59單克隆抗體活化前后LAT在細(xì)胞膜上的定位。
　　結(jié)果：靜脈移植Jurkat細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組小鼠逐漸出現(xiàn)病態(tài)體征，表現(xiàn)為嗜睡、食欲減退、體質(zhì)量減輕、精神萎靡、弓背、后肢癱瘓等癥狀，外周血WBC計(jì)數(shù)呈增高趨勢(shì)，生存時(shí)間較對(duì)照組明

4、顯縮短，肝脾組織HE染色及骨髓涂片光鏡下觀察均可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，建模成功，對(duì)照組小鼠活力正常均存活。實(shí)驗(yàn)組中LAT組小鼠第四周即出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，伴脊柱側(cè)彎，呈惡病質(zhì)，WBC計(jì)數(shù)高于其他各組。ELISA檢測(cè)結(jié)果示LAT組血清中IL-2表達(dá)水平高于LAT-M組和Jurkat組。促凋亡因子Caspase-3在LAT-M組中的表達(dá)高于LAT組和Jurkat組，促進(jìn)細(xì)胞活化的Bcl-2蛋白，在LAT組中的表達(dá)高于LAT-M組和Jurkat組，且LA

5、T-M組表達(dá)水平低于Jurkat組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到LAT組白血病細(xì)胞增殖率高于LAT-M組和Jurkat組。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察LAT組提示，于細(xì)胞膜上可見(jiàn)LAT分布且點(diǎn)簇狀聚集于脂筏，經(jīng)CD59單抗交聯(lián)后，點(diǎn)簇狀聚集較刺激前更為明顯；而在LAT-M組中，可見(jiàn)LAT分子散在分布，未見(jiàn)點(diǎn)簇狀聚集，CD59抗體作用后無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：成功建立T系Jurkat白血病細(xì)胞裸鼠動(dòng)物模型。從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)LAT分子及其棕櫚?；赥細(xì)