脂筏特征蛋白flotillin-2的調(diào)控及功能研究.pdf

1、近10年來的研究表明,在生物膜上存在著富含鞘脂和膽固醇的微區(qū)結(jié)構(gòu)(microdomain)——脂筏(Lipidrafts),該區(qū)域內(nèi)存在著大量和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白,包括GPI錨聯(lián)蛋白、G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體和激酶等。除此之外,脂筏主要包含特有的、標(biāo)志性的結(jié)構(gòu)蛋白,包括flotillin(reggie),caveolin和stomatin等,它們與上述信號(hào)分子相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合體,進(jìn)一步調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　Flotillin

2、蛋白家族由兩個(gè)同源性較高的蛋白flotillin-1和flotillin-2所構(gòu)成,flotillin和紅細(xì)胞膜上的stomatin(Band7.2b)、線粒體的prohibition及細(xì)菌的HflK/HflC之間的同源性也相當(dāng)高,其中同源性最強(qiáng)的序列稱為SPFH結(jié)構(gòu)域,位于flotillin的N端,該結(jié)構(gòu)域的可能功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜之間的結(jié)合。此外,在flotillin的C端還存在另一結(jié)構(gòu)域,flotillin結(jié)構(gòu)域,被認(rèn)為參與形

3、成卷曲螺旋結(jié)構(gòu),通過這一結(jié)構(gòu),flotillins之間可以形成同源和異源寡聚體。
　　因此,如果能了解flotillin-2這一脂筏特征結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控機(jī)理,不僅對(duì)于闡明脂筏這一特殊的膜微區(qū)結(jié)構(gòu)里蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-脂質(zhì)之間的相互作用具有重要意義,而且對(duì)于理解整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床實(shí)踐均有重要意義。為了篩選出能與flotillin-2相互作用的蛋白,通過酵母雙雜交的手段,我們篩選到flotillin-2可

4、與ASB-7(Ankyrinrepeatandsuppressorofcytokinesignaling(SOCS)boxprotein7)特異作用。ASB-7屬于ASB蛋白家族,該家族是SOCSbox超家族的主要成員。現(xiàn)有研究結(jié)果說明,ASB家族蛋白質(zhì)氨基端的ankyrinrepeat結(jié)構(gòu)域主要和底物結(jié)合,而羧基端的SOCSbox結(jié)構(gòu)域是構(gòu)成泛素連接酶E3的元件之一,當(dāng)ASB家族蛋白與Cul-5平臺(tái)蛋白,RING家族蛋白。Rbx-2以

5、及其他接頭蛋白(如Skpl和:ElonginB/C復(fù)合體等)形成E3復(fù)合體后,可促進(jìn)E2和其結(jié)合的底物蛋白之間的相互作用,進(jìn)而通過泛素化途徑使得底物降解。
　　通過一系列的體內(nèi)細(xì)胞共定位以及體外pulldown實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們確認(rèn)了兩者的相互作用,并且把相互作用位點(diǎn)定位在了flotillin-2N端的SPFH結(jié)構(gòu)域和ASB-7N端的ankyrinrepeat結(jié)構(gòu)域。然后通過過表達(dá)與干擾改變了ASB-7表達(dá)水平,然后檢測(cè)flotil

6、lin-2體內(nèi)表達(dá)的變化,從而確認(rèn)了ASB-7確實(shí)是通過SOCS結(jié)構(gòu)域參與的途徑對(duì)flotillin-2進(jìn)行負(fù)調(diào)控。
　　接下來我們希望大規(guī)模的生產(chǎn)出大量重組的人flotillin-2蛋白用于蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)研究從而解析其結(jié)構(gòu),因?yàn)閒lotillin-2等脂筏蛋白難溶于TritonX-100等常規(guī)去垢劑,使得脂筏蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究很難進(jìn)行。于是我們通過基因克隆的方法,在大腸桿菌中大量表達(dá)重組的flotillin-2,我們成功地表達(dá)了5種

7、融合了不同接頭的重組flotillin-2:His-Flot2,TRX-Flot2,GST-Flot2,NusA-Flot2和MBP-Flot2。經(jīng)過優(yōu)化克隆和表達(dá)條件,選取了最佳的MBP-Flot2進(jìn)行大規(guī)模表達(dá),并通過離子交換層析和親和層析,每表達(dá)一升細(xì)菌培養(yǎng)液可以得到了36.0mg,純度超過97％的重組蛋白。并通過生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了重組蛋白的生化活性。
　　此外,對(duì)有可能參與flotillin-1/arginase-1相互作用體