脂筏標(biāo)志蛋白Flotillin-1在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、目的：研究脂筏標(biāo)志蛋白 Flotilin-1在小細(xì)胞肺癌病人肺癌組織中的表達(dá)情況以及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探討Flotilin-1抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、應(yīng)用全細(xì)胞指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）的篩選方法，篩選出多條能特異性識(shí)別小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的核酸適配體C1、C3、C7、C12。
　　2、體外合成生物素標(biāo)記的序列C1、C3、C7、C12

2、作為誘餌，釣取與之結(jié)合的蛋白。采用質(zhì)譜鑒定所結(jié)合的蛋白，根據(jù)質(zhì)譜分析得分情況挑選了脂筏標(biāo)志蛋白FLOT1做后續(xù)研究。
　　3、應(yīng)用核酸Pull-down驗(yàn)證FLOT1與C12是否特異性結(jié)合。
　　4、應(yīng)用免疫組化檢測(cè)FLOT1在肺部疾病組織芯片的表達(dá)情況。
　　5、應(yīng)用免疫組化檢測(cè)FLOT1在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況。
　　6、應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)FLOT1在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的定位。
　　7、應(yīng)用 RTCA

3、MP實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析儀、Transwell遷移和 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低FLOT1對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活性、遷移能力和侵襲能力的影響。
　　8、建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系shNC,shFLOT1-1,shFLOT1-2，應(yīng)用western-blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞敲降效率。
　　9、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（ Flow Cytometry, FCM）檢測(cè)敲低 FLOT1后NCIH446 cells細(xì)胞周期的改變。
　　10、Western

4、blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低FLOT1后cyclinD1的表達(dá)情況。
　　11、對(duì) FLOT1進(jìn)行敲降后，經(jīng)不同濃度順鉑誘導(dǎo) shNC, shFLOT1-1, shFLOT1-2三組小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，檢測(cè)三組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2， Caspase3，PAKT，PARP的表達(dá)情況。
　　12、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)順鉑誘導(dǎo)后三組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡情況。
　　13、行裸鼠皮下成瘤及裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn),檢測(cè)shNC， shFL

5、OT1-1兩組裸鼠小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移情況。
　　14、用表達(dá)譜芯片尋找 shNC和 shFLOT1-1兩組細(xì)胞中表達(dá)差異的mRNA。
　　15、在兩組細(xì)胞中應(yīng)用 Real-timePCR對(duì)表達(dá)譜芯片結(jié)果挑選出的CDC42、SOX11、CXCR2、Twist2的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　16、應(yīng)用Western blot檢測(cè)TGF-β，H-Ras在shNC、shFLOT1-1和shFLOT1-2三組細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)

6、果：
　　1、質(zhì)譜分析結(jié)果顯示脂筏蛋白FLOT1能夠與C12結(jié)合。
　　2、核酸pulldown結(jié)果顯示FLOT1與C12特異性結(jié)合。
　　3、組織芯片免疫組化結(jié)果顯示FLOT1在大部分肺部疾病中表達(dá)上調(diào)，在健康人肺組織中不表達(dá)或低表達(dá)。
　　4、小細(xì)胞肺癌病人免疫組化顯示 FLOT1在癌組織中表達(dá)上調(diào)，在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。
　　5、免疫熒光結(jié)果顯示 FLOT1大部分定位于細(xì)胞膜上，僅少量在細(xì)胞漿中

7、表達(dá)。
　　6、RTCA MP實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析結(jié)果顯示，敲降FLOT1后小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446和NCIH1688增殖活性明顯降低(P<0.05)。
　　7、Transwell遷移結(jié)果顯示，敲降FLOT1后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446和NCIH1688細(xì)胞遷移能力降低（P<0.05）。Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降FLOT1-1后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446和NCIH1688細(xì)胞侵襲能力減弱（P<0.05）。

8、
　　8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示敲低 FLOT1后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCIH446細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期（P<0.05）。
　　9、Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，敲低FLOT1后,小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446中cyclinD1的表達(dá)降低。
　　10、Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，敲低FLOT1后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCIH446在經(jīng)順鉑處理后Bcl-2，PAKT的表達(dá)量增加，且Caspase3和PARP剪切比例

9、增加。
　　11、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)順鉑誘導(dǎo)后敲低FLOT1的NCIH446的細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.05）。
　　12、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降FLOT1-1組皮下腫瘤重量降低（P<0.05)。
　　13、裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：sh-NC組裸鼠肺部發(fā)現(xiàn)了大量癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,shFLOT1-1和sh FLOT1-2組肺部未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)少量癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶。
　　14、Real-time PCR結(jié)果顯

10、示敲低FLOT1后，CDC42、SOX11、Twist2相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)。
　　15、Western blot結(jié)果顯示TGF-β，H-Ras在shFLOT1-1、shFLOT1-2兩組細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)于在shNC組表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　脂筏蛋白FLOT1在小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào),抑制FLOT1的表達(dá)能抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖活性及克隆形成能力，且能夠抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，還可促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)