肛門直腸畸形大鼠盆底肌異常發(fā)育機制及成肌細胞移植治療的實驗研究.pdf

1、前言：先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations,ARMs)是最常見的小兒消化道畸形,是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,發(fā)病率為1/5000～1/1500。盡管長期以來對肛門直腸畸形的手術(shù)方式的不斷改進及術(shù)后監(jiān)護水平的不斷提高,其總體預(yù)后得到了明顯改善。但長期隨訪發(fā)現(xiàn),仍有許多中高位肛門直腸畸形患兒術(shù)后存在不同程度的排便功能障礙,嚴(yán)重影響患兒的生理及心理健康。術(shù)后肛門直腸功能不良取決于許

2、多因素,諸如盆底神經(jīng)肌肉發(fā)育異常、腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙、骶尾椎畸形等等。而盆底肌作為控制排便功能的關(guān)鍵元素,其發(fā)育程度無疑是決定術(shù)后排便功能最重要的因素之一。
　　 大量臨床研究及前期動物實驗均已發(fā)現(xiàn),中高位肛門直腸畸形伴有不同程度的盆底肌發(fā)育異常,是導(dǎo)致術(shù)后排便功能障礙的主要原因。但迄今為止,肛門直腸畸形盆底肌胚胎異常發(fā)育機制尚不清楚,也缺乏有效地、有針對性的治療方法。
　　 凋亡在胚胎發(fā)育及維持組織穩(wěn)定等各種生理過程中

3、起關(guān)鍵作用,也參與多種病理過程。在骨骼肌的不同發(fā)育階段,如原始肌團分離形成各組肌肉、神經(jīng)肌肉接頭形成、不同類型肌纖維比例改變及肌肉塑形重建過程中均有凋亡的參與。研究發(fā)現(xiàn),在肛門直腸畸形胚胎尾腸退化、尿直腸隔與泄殖腔膜融合及肛膜破裂時均存在異常凋亡現(xiàn)象。在正常盆底肌胚胎發(fā)育過程中是否有凋亡的參與,凋亡在肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育過程中是否也起作用目前尚不得而知。
　　 隨著分子生物學(xué)的研究進展以及細胞示蹤技術(shù)的應(yīng)用,已初步闡明骨骼

4、肌胚胎發(fā)育的發(fā)生機制。脊椎動物的骨骼肌起源于體節(jié),體節(jié)來源的生肌祖細胞在周圍信號因子的作用下啟動生肌程序。而位于肢體水平的體節(jié),其生皮肌節(jié)側(cè)緣去上皮化,生肌祖細胞分離形成單個細胞,在各種趨化因子的引導(dǎo)下,向遠處移行。到達靶定部位后,在局部信號作用下,激活肌特異性基因,表達生肌調(diào)節(jié)因子,啟動肌細胞分化增殖,形成骨骼肌原始肌纖維。在胚胎發(fā)育晚期,基底膜形成以后,部分生肌祖細胞定植于基底膜與肌纖維膜之間轉(zhuǎn)化形成衛(wèi)星細胞,保持不分裂、靜止?fàn)顟B(tài)。

5、骨骼肌的發(fā)育成熟是在原始肌纖維基礎(chǔ)上,通過衛(wèi)星細胞活化增殖并啟動成肌過程,同原有的骨骼肌細胞相互融合,或是彼此融合,形成新的骨骼肌纖維。作為骨骼肌的專性干細胞,衛(wèi)星細胞在正常盆底肌的胚胎動態(tài)發(fā)育過程如何;在肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育時是否也存在衛(wèi)星細胞發(fā)育缺陷;干細胞賴以生存并為其提供各種支持的微環(huán)境發(fā)育情況,目前在國內(nèi)外文獻中均未見報道。
　　 當(dāng)前對排便功能障礙的治療主要局限于功能刺激生物反饋及周圍肌肉轉(zhuǎn)移替代治療方面,通過

6、改變肛管直腸角或建立神經(jīng)反射弧等來促進排便控制,沒有從根本上解決盆底肌發(fā)育不良問題。雖然取得了一定的近期療效,但長期隨訪發(fā)現(xiàn)并不能達到滿意的控制排便功能。骨骼肌衛(wèi)星細胞作為骨骼肌專性干細胞,具有在體內(nèi)或體外分化成肌的能力,已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于基礎(chǔ)實驗及臨床研究,在缺血心肌再生、膈肌重建及膀胱括約肌重建等方面取得了成功。應(yīng)用衛(wèi)星細胞移植治療盆底肌發(fā)育不良有望成為改善肛門直腸畸形術(shù)后排便功能極具前景的治療策略。
　　 本文應(yīng)用乙烯

7、硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸建立的Wistar大鼠ARMs動物模型,研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌胚胎發(fā)育過程中的細胞凋亡,以及Bcl-2/Bax時空表達差異;同時研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌衛(wèi)星細胞及其微環(huán)境的胚胎動態(tài)發(fā)育,分別從細胞凋亡及干細胞水平探索肛門直腸畸形盆底肌異常發(fā)育潛在機制。另外通過提取骨骼肌衛(wèi)星細胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖,綠色熒光蛋白標(biāo)記后種植入經(jīng)物理化學(xué)方法建立的橫紋肌復(fù)合體去細胞支架

8、內(nèi),移植入盆底后觀察在體內(nèi)分化形成骨骼肌情況,探索衛(wèi)星細胞移植治療肛門直腸畸形盆底肌發(fā)育不良的可行性。
　　 實驗材料：
　　 1.實驗動物
　　 體重250～300克的Wistar大白鼠,體重80-100克Wistar公鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供。
　　 2.實驗試劑
　　 ①乙烯硫脲Ethylenethiourea,ETU(購自德國Sigma-Aldrich公司)；
　

9、　 ②TUNEL試劑盒(購自德國Roche公司)；
　　 ③Bcl-2/Bax抗體、Myogenin抗體及SYP抗體(購自美國Santa Cruz公司),Vimentin抗體、Neurofilament抗體、vWF抗體、Desmin抗體及Myosin抗體(購自美國Lab Vision公司),Laminin抗體(購自英國Abcam公司),MyoD抗體(購自美國BD公司),Pax7抗體(購自美國R&D公司),GFP抗體(購自美國C

10、hemicon公司)；
　　 ④山羊抗小鼠IgG-TRITC(購自美國Chemicon公司),山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488(購自美國Invitrogen公司),免疫組化超敏試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),二步法山羊免疫組化檢測試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；
　　 ⑤eGFP腺病毒(購自北京諾賽基因組研究中心有限公司)；
　　 ⑥bFGF(購自英國Pepro公司),鼠尾膠原

11、(購自杭州生友生物技術(shù)有限公司),Ⅰ型膠原酶(購自德國Sigma-Aldrich公司),胰酶(購自美國HyClone公司),胎牛血清(購自美國GIBCO公司),Ham's F10培養(yǎng)基(購自美國GIBCO公司)；
　　 ⑦逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自大連寶生物工程有限公司)。
　　 實驗方法：
　　 1.動物模型制備及病理切片Wistar孕鼠于妊娠第10天(E10),按125mg/kg經(jīng)胃管給予1％ETU,制作ARMs大鼠

12、動物模型,對照組給予等量的生理鹽水。妊娠第16-21天剖宮取胎,尾部軀干經(jīng)4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋,進行矢狀面、橫斷面或冠狀面連續(xù)切片。
　　 2.盆底肌胚胎發(fā)育過程中的細胞凋亡研究應(yīng)用TUNEL染色、DNA ladder方法研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌發(fā)育過程中的細胞凋亡現(xiàn)象。同時通過Bcl-2/Bax的免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR方法,研究Bcl-2/Bax在盆底肌胚胎發(fā)育過程中的時空表達,

13、探索其對盆底肌凋亡的可能調(diào)控作用。
　　 3.盆底肌衛(wèi)星細胞及其微環(huán)境的胚胎發(fā)育研究應(yīng)用免疫熒光化學(xué)染色及real-time PCR技術(shù),研究正常胎鼠及肛門直腸畸形胎鼠盆底肌衛(wèi)星細胞胚胎動態(tài)發(fā)育,并且對衛(wèi)星細胞進行超微結(jié)構(gòu)分析、衛(wèi)星細胞分離培養(yǎng)及分化能力的鑒定。通過對vWF、Neurofilament、Vimentin蛋白進行免疫熒光化學(xué)染色,研究衛(wèi)星細胞微環(huán)境的胚胎發(fā)育,從干細胞水平探索盆底肌異常發(fā)育的可能發(fā)生機制。
　

14、　 4.成肌細胞移植重建盆底橫紋肌復(fù)合體提取肌衛(wèi)星細胞進行體外培養(yǎng)分化形成成肌細胞,應(yīng)用免疫熒光染色及流式細胞技術(shù)鑒定,經(jīng)攜帶eGFP的腺病毒轉(zhuǎn)染后,移植入經(jīng)過物理化學(xué)方法處理建立的橫紋肌復(fù)合體去細胞支架中,帶細胞支架移植回體內(nèi)4周后檢測其在體內(nèi)分化形成骨骼肌情況,初步探索成肌細胞移植治療盆底肌發(fā)育不良的可行性。
　　 5.結(jié)果統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均以(x-)±s表示,差異比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行各胎齡正常組與ARMs

15、組的t檢驗或單因素方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.肛門直腸畸形盆底肌發(fā)育過程中的細胞凋亡模式改變正常胎鼠16天時,盆底橫紋肌復(fù)合體未見明顯的TUNEL陽性凋亡細胞,孕17天以后出現(xiàn)的零星陽性細胞主要集中在橫紋肌復(fù)合體與球海綿體肌交界區(qū)及直腸后兩側(cè)橫紋肌復(fù)合體匯合處。肛門直腸畸形胎鼠,TUNEL陽性細胞在孕16天時就非常明顯,大量的陽性細胞主要分布在橫紋肌復(fù)合體的背側(cè)。兩組間各孕齡組凋

16、亡指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。DNA ladder結(jié)果顯示畸形組條帶更加明顯。
　　 2.Bcl-2/Bax的時空表達差異免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR結(jié)果表明,E16時未見明顯的Bcl-2/Bax的表達,E17后Bcl-2/Bax的表達逐漸增強。與正常組比較,肛門直腸畸形大鼠盆底肌存在Bcl-2/Bax的時空表達異常,Bcl-2表達明顯下調(diào),分別為0.44±0.06 vs.0.49±0.07(17天),0.69±0.09 vs.0

17、.90±0.14(19天),0.51±0.07 vs.0.71±0.11(21天),孕19及21天時有顯著性差異。而Bax基因表達上調(diào),分別為0.39±0.04 vs.0.31±0.03(17天),0.47±0.05 vs.0.37±0.04(19天),0.40±0.05 vs.0.37±0.05(21天),孕17及19天時差異有顯著性意義。
　　 3.盆底肌衛(wèi)星細胞胚胎動態(tài)發(fā)育過程異常對Myogenin及Pax7的定性及定量研

18、究發(fā)現(xiàn),正常胎鼠16天時盆底肌已有Myogenin陽性表達,隨著胎齡增加,Myogenin表達逐漸增強;孕17天以后出現(xiàn)Pax7陽性的衛(wèi)星細胞,孕19天陽性率最高,孕21天時有時下降。而肛門直腸畸形胎鼠盆底肌Myogenin表達明顯減弱,胚胎晚期差異愈發(fā)明顯;孕16天時即有較強的Pax7陽性表達,孕17天后表達增強,與正常組比較,Pax7陽性細胞比例明顯增加。
　　 4.衛(wèi)星細胞超微結(jié)構(gòu)變化透射電鏡掃描提示正常組盆底肌肌纖維排列

19、規(guī)則,肌橫紋明顯;衛(wèi)星細胞位于基底膜與肌漿膜之間,細胞規(guī)則,核漿比例較高,胞核呈橢圓形;胞膜與肌漿膜緊密接觸,被薄薄的基底膜共同包繞。肛門直腸畸形盆底肌肌纖維排列紊亂,肌橫紋不明顯;衛(wèi)星細胞細胞核形態(tài)不規(guī)則、異染色質(zhì)增多;衛(wèi)星細胞與肌細胞間的細胞間隙增大,基底膜明顯增厚。
　　 5.肛門直腸畸形盆底肌衛(wèi)星細胞分化障礙從胎鼠盆底肌提取的衛(wèi)星細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后進行細胞分化能力鑒定,培養(yǎng)24小時后,兩組細胞均表現(xiàn)出MyoD/Myogen

20、in陽性表達;培養(yǎng)72小時后,正常組細胞MyoD表達明顯下降(11.83％),而畸形組細胞仍有較高比例的MyoD表達(35.28％);培養(yǎng)120h后正常組細胞每個視野下可見到平均10個Myosin陽性的多核肌管形成,而畸形組Myosin陽性細胞明顯減少,兩組間具有顯著差異。
　　 6.肛門直腸畸形時盆底肌衛(wèi)星細胞微環(huán)境發(fā)育缺陷免疫熒光化學(xué)染色顯示在正常組中,vWF表達明顯,在SMC橫斷面上呈均勻分布,可見較多Neurofilam

21、ent陽性表達的神經(jīng)纖維,肌束之間可見少量Vimentin陽性表達。而在ARMs組,vWF表達較弱,多分布在橫紋肌復(fù)合體的周邊,Neurofilament的表達極其微弱,幾乎在每根肌束周圍都可見Vimentin陽性表達的纖維組織。
　　 7.分離培養(yǎng)的衛(wèi)星細胞存在兩個不同的亞群貼壁較早的細胞增殖速度較快,傳代能力有限,很快分化融合成多核肌管;而晚貼壁細胞中有較多呈球形或短梭形的細胞,該群細胞有較高的核漿比例,表達衛(wèi)星細胞特異性標(biāo)

22、記Pax7,保持干細胞或類似干細胞狀態(tài),其增殖速度慢,傳代次數(shù)相對較多。隨著培養(yǎng)時間延長,晚貼壁細胞中仍有較高比例的短梭形細胞存在。
　　 8.提取培養(yǎng)的衛(wèi)星細胞在體外具有分化成肌能力衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)后能分化形成Desmin染色陽性的成肌細胞,并融合形成Myosin陽性的多核肌管,分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后在倒裝顯微鏡下可以見到肌纖維的自主收縮。
　　 9.移植的成肌細胞在體內(nèi)分化形成肌纖維攜帶成肌細胞的橫紋肌復(fù)合體支架移植

23、入體內(nèi)后分化形成肌團,免疫熒光染色提示Myosin及GFP雙重表達陽性,在肌纖維周圍可見vWF陽性染色的血管內(nèi)皮細胞,肌纖維膜下可見Pax7陽性染色細胞,占據(jù)衛(wèi)星細胞位置。
　　 結(jié)論：
　　 1.凋亡在正常橫紋肌復(fù)合體胚胎發(fā)育過程中起重要作用;異常凋亡可能是肛門直腸畸形時橫紋肌復(fù)合體發(fā)育不良的基本病理過程;Bcl-2/Bax的時空表達仍然是調(diào)節(jié)橫紋肌復(fù)合體凋亡的重要因子。
　　 2.過早形成了衛(wèi)星細胞使得形成肌