先天性肛門直腸畸形發(fā)病的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：miRNA-mRNA芯片聯(lián)合篩選肛門直腸畸形的致病基因
　　目的:檢測(cè)肛門直腸畸形(Anorectal Malformations，ARMs)患者直腸末端組織中的miRNA表達(dá)譜、mRNA表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，初步探討肛門直腸畸形的發(fā)生發(fā)展的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。
　　方法:選取我院2013年5月至10月診斷為ARMs的患兒直腸盲端組織標(biāo)本7例作為實(shí)驗(yàn)組，其中男5例，女2例，中高位閉鎖4例，低位3例

2、，另取3例尸檢嬰兒（死于非腸道疾病）直腸末端標(biāo)本作正常對(duì)照。Trizol法提取總RNA并檢測(cè)質(zhì)量，運(yùn)用miRNA、mRNA芯片進(jìn)行分別檢測(cè)，篩選三組差異表達(dá)的 miRNA、mRNA，對(duì)差異基因及miRNA做趨勢(shì)分析，篩選得到顯著性的基因表達(dá)趨勢(shì)，對(duì)差異 miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并與篩選得到的差異基因取交集，得到交集基因1，對(duì)交集基因1進(jìn)行Gene Ontology基因功能及生物學(xué)通路富集分析，利用Cytoscape軟件整合 KEGG、

3、HPRD、BIOGRID、INTACT、MINT等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)顯著性差異的GO及Pathway條目下的所包含的基因進(jìn)行相互作用分析，找出其中的關(guān)鍵調(diào)控基因。選取其中4個(gè)采用實(shí)時(shí)定量 PCR驗(yàn)證，運(yùn)用單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:通過(guò)將對(duì)照組、低位組、高位組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，篩選出8011個(gè)差異基因及88個(gè)差異 microRNA。mRNA顯著性趨勢(shì)有4個(gè)，miRNA顯著性趨勢(shì)有2個(gè)，miRNA靶基因預(yù)測(cè)后與mRNA取負(fù)交集共得到

4、差異基因2705個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，顯著性差異的GO條目為轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程、胚胎形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌細(xì)胞分化等；對(duì)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要位于腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、EB病毒感染、細(xì)胞骨架調(diào)控、鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤調(diào)控等通路。將顯著差異GO及Pathway條目下的基因進(jìn)行基因、基因產(chǎn)物相互作用分析，得到的Signal-Net網(wǎng)絡(luò)分析其中的核心基因，包括 MAPK1、FGFR2、

5、EP300、SRC、PLCB1、CDC42、MLLT4、TJP1等，根據(jù) microRNA和靶基因之間調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建microRNA-Gene-Network，關(guān)鍵 microRNA包括 has-miR-124-3p、has-miR-29c-3p、 has-miR-1185-2-3p、 has-miR-103a-3p、has-miR-4795-3p等，選取基因MAPK1、FGFR2、EP300進(jìn)行Real-Time PCR驗(yàn)證，均具有顯

6、著性差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:運(yùn)用miRNA-mRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)工具對(duì)ARMs發(fā)生相關(guān)的差異基因進(jìn)行深入分析，最終篩選到與該病發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因，證明基因網(wǎng)絡(luò)在肛門直腸畸形的的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)控作用，篩選的差異基因可能成為今后研究ARMs的新方向。
　　第二部分：維生素A及其相關(guān)基因在肛門直腸畸形發(fā)病中的作用研究
　　目的:檢測(cè)血清維生素A水平、組織中維生素A相關(guān)受體表達(dá)水平、與維生素A相關(guān)的新基

7、因HA117及其相鄰的DPF3基因表達(dá)水平與先天性肛門直腸畸形患兒發(fā)病的關(guān)系，探討維生素A在肛門直腸畸形發(fā)病中的作用。
　　方法:1、隨機(jī)選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院胃腸、新生兒外科2012年5月至2013年9月診斷為ARMs的患兒35例，其中男22例，女13例，年齡1天—8月23天，其中低位閉鎖11例，中位閉鎖12例，高位閉鎖12例，收集術(shù)后切除患兒直腸盲端組織作為實(shí)驗(yàn)組；另取7例尸檢嬰兒（死于非腸道疾?。┲蹦c末端組織標(biāo)本作為對(duì)

8、照組。Trizol法提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組組織標(biāo)本中的 HA117、DPF3b、RARα、RARβ、RARγ的表達(dá)量，提取組織蛋白，運(yùn)用western-blot方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組組織標(biāo)本中 DPF3b、RARα、RARβ蛋白表達(dá)水平2、第一次入院時(shí)抽取35例患兒靜脈血2ml，收集上清；另收集10例正常新生兒血清作為對(duì)照組，采用高相液相色譜法對(duì)兩組血清標(biāo)本vitA水平進(jìn)行檢測(cè)3、采用SPSS19

9、.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、Q-PCR結(jié)果顯示，肛門直腸畸形患兒直腸盲端組織中RARα表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），RARα表達(dá)量隨盲端位置升高而表達(dá)降低；RARβ在中高位、低位ARMs與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RARγ在 ARMs各類型組織中表達(dá)與對(duì)照組未見明顯差異（P＞0.05），HA117表達(dá)量中高位組、低位組較對(duì)照

10、組均有明顯差異（P＜0.01），三組表達(dá)量依次下降；DPF3b與HA117相反，三組表達(dá)依次增高；2、western-blot檢測(cè) DPF3b、RARα、RARβ蛋白表達(dá)水平，DPF3b在對(duì)照組、低位組、中高位組依次降低，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；RARα在中高位組表達(dá)明顯下降，低位組表達(dá)較對(duì)照組也降低（P＜0.05）；RARβ在中高位組、低位組表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異；3、實(shí)驗(yàn)組中高位、低位患兒血清維生素 A水平較對(duì)照組明顯

11、降低（P＜0.01），分別為0.37±0.11，0.38±0.14，0.90±0.09μmol/L，按病理類型分組，中高、低位ARMs組間患兒血清VitA水平未見明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:維生素A及其受體在胚胎期腸道發(fā)育中至關(guān)重要，維生素A缺乏可能是引起肛門直腸畸形發(fā)病原因之一。新發(fā)現(xiàn)的維生素A相關(guān)基因HA117可能通過(guò)與DPF3負(fù)調(diào)控參與了其發(fā)病過(guò)程。
　　第三部分：以慢病毒為載體跨胎盤RNAi RARα基因構(gòu)

12、建腸道畸形小鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:應(yīng)用慢病毒載體，采用跨胎盤RNA干擾技術(shù)干擾胚胎鼠RARα基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)探索基因部分下調(diào)小鼠的高效技術(shù)，并觀察干擾RARα基因后的小鼠腸道發(fā)育情況。
　　方法:構(gòu)建維生素A特異性受體基因RARα干擾慢病毒，將重組干擾慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 C3H10T1/2，通過(guò)RT-PCR、Western-blot方法驗(yàn)證其對(duì)RARα基因的干擾效果；通過(guò)尾靜脈向孕期9天時(shí)母鼠分別注射RAR

13、α-RNAi慢病毒載體、空載病毒載體及Ringer’s液。注射96小時(shí)后處死部分孕鼠，取出胚胎觀測(cè)胚胎變化，體視熒光儀檢測(cè)胚胎熒光表達(dá)情況，并采用 Western blotting及 RT–PCR檢測(cè)RARα、Sonic hedgehog(Shh)、HA117的表達(dá)情況；剩余孕鼠自然分娩后觀察子代鼠腸道發(fā)育情況，采用適當(dāng)指標(biāo)對(duì)腸道發(fā)育情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:1）RARα-RNAi慢病毒載體及LV-vector空病毒可以成功感染

14、C3H10T1/2，干擾有效；2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，尾靜脈注射病毒96小時(shí)后體式熒光可以檢測(cè)到熒光，注射108Tu/只病毒量較其他注射量明顯（P＜0.05）；3）RARα-RNAi組胚胎RARα基因mRNA及蛋白表達(dá)較空載組、Ringer’s對(duì)照組明顯下調(diào)（P＜0.01）；4）Ringer’s組、空載對(duì)照組胚胎及新生鼠中未見明顯發(fā)育異常，RARα-RNAi胚胎及新生鼠中發(fā)現(xiàn)肛門閉鎖、四肢及脊柱發(fā)育異常、頭面部發(fā)育異常等畸形鼠；5）RARα-R

15、NAi組小鼠腸道組織與其他組比較，發(fā)育遲緩，肌層較薄，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不良，RARα、Shh、HA117表達(dá)水平低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：采用慢病毒作為載體實(shí)現(xiàn)跨胎盤RNA干擾，方法可行、干擾有效，可實(shí)現(xiàn)干擾動(dòng)物體內(nèi)基因部分表達(dá)的效果，構(gòu)建基因下調(diào)模型動(dòng)物；RARα基因在胚胎發(fā)育中起到重要作用，部分干擾 RARα基因可導(dǎo)致小鼠腸道發(fā)育畸形及其他畸形，其機(jī)制可能是通過(guò)RARα/Shh信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
　　第四部分：采用二代測(cè)

16、序技術(shù)探討相關(guān)基因在ARMs發(fā)生中的作用
　　目的:采用第二代測(cè)序技術(shù)探討基因 RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP300、FGFR2在肛門直腸畸形中的作用，對(duì)這些基因進(jìn)行突變篩查。
　　方法:收集我院50例2013年5月至2014年12月診斷為ARMs患兒血液標(biāo)本，提取外周血全基因組 DNA，設(shè)計(jì)針對(duì) RARα、RARβ、HA117、DPF3、MAPK1、FOXO3、Shh、EP3

17、00、FGFR2外顯子區(qū)域的特異性探針，利用多重PCR擴(kuò)增的方法對(duì)引物進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，并采用Hiseq2500進(jìn)行測(cè)序，使用SOAPsnp及GATK軟件分析樣本SNP及突變信息，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及分析，確定突變位點(diǎn)。
　　結(jié)果:設(shè)計(jì)合成的目標(biāo)基因特異性捕獲探針可有效地富集基因組DNA的外顯子區(qū)域。在50個(gè)樣本中共發(fā)現(xiàn)31個(gè)突變位點(diǎn)，其中錯(cuò)義突變15個(gè)，無(wú)義突變16個(gè)。與亞洲人這些突變位點(diǎn)發(fā)生率進(jìn)行比對(duì)，有10個(gè)差別較大的位點(diǎn)，其中7個(gè)

18、為錯(cuò)義突變，且全部位于 FoxO3基因上。7個(gè)位點(diǎn)中的3個(gè)為新發(fā)現(xiàn)突變，分別為c1582 T＞G、c874 C＞T、c1088 T＞A，有5個(gè)可以導(dǎo)致氨基酸疏水性改變，包括rs199833934/rs9635679、 rs201947198/rs9635700、c1241 T＞A、c1088 T＞A、c874 C＞T。
　　結(jié)論:多重?cái)U(kuò)增測(cè)序技術(shù)能夠發(fā)掘 ARMs發(fā)病相關(guān)的新突變，該方法快速有效。FoxO3上的突變位點(diǎn)可能與ARM