正常及先天性肛門直腸畸形大鼠盆底肌肉發(fā)育的對比研究.pdf

1、先天性肛門直腸畸形(Anorectal Malformations，ARMs)是小兒常見的消化道畸形，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測的先天畸形之一，占消化道畸形的1/4，發(fā)病率為1/5000～1/1500。盡管長期以來人們對肛門直腸畸形的手術(shù)方式進(jìn)行著不斷的改進(jìn)，但中、高位ARMs的術(shù)后長期隨訪顯示，仍有許多患者存在不同程度的排便、控便功能障礙。術(shù)后肛門直腸功能障礙是盆底神經(jīng)肌肉發(fā)育不良所致，而盆底肌肉作為排便控制器官的焦點(diǎn)，無疑是影響直腸肛管

2、控便屏障最重要的因素之一。 研究顯示，在中、高位肛門直腸畸形中，直腸肛管周圍的肌肉和肛管末端平滑肌均有不同程度的改變，但迄今為止，對肛門直腸畸形盆橫紋肌和消化道末端平滑肌的胚胎發(fā)育過程和病理改變尚不清楚。 分子生物學(xué)的研究進(jìn)展已初步闡明肌肉胚胎學(xué)發(fā)生的機(jī)制。生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors，MRFs)在肌肉發(fā)育過程中起到了至關(guān)重要的作用，肌前體細(xì)胞遵循著由生肌調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)的分化途徑進(jìn)行

3、分化。Wnt信號通路在胚胎發(fā)育中通過經(jīng)典信號通路、激酶依賴信號通路調(diào)節(jié)MRFs的活性；另有觀點(diǎn)認(rèn)為，Wnt信號可能通過參與染色質(zhì)構(gòu)象的改變而影響MRFs的活性。Wnt信號對于生肌調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)作用，已從最初的單一的線性調(diào)節(jié)通路發(fā)展到目前的網(wǎng)絡(luò)樣調(diào)節(jié)通路。但ARMs盆底肌發(fā)育異常的機(jī)制目前尚不清楚。 本文應(yīng)用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸的Wistar大鼠ARMs動物模型，通過H&E染色并以MyoD和My

4、ogenin作為胚胎期骨骼肌前體的特異性標(biāo)志物，以α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)作為胚胎期腸道平滑肌的特異性標(biāo)志物，研究發(fā)育中的盆底橫紋肌和消化道末端平滑肌的形態(tài)學(xué)變化過程；研究Wnt1、MyoD、Myogenin蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠胚胎盆底肌發(fā)生過程中的表達(dá)情況；探討正常及ARMs大鼠盆底排便控制相關(guān)肌肉的胚胎期形態(tài)發(fā)育過程和盆底肌發(fā)育相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)情況?！?實(shí)驗(yàn)

5、材料： 實(shí)驗(yàn)動物：體重250～300克的Wistar大白鼠由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物部提供。試劑：①M(fèi)yogenin單克隆抗體、α-SMA單克隆抗體購自美國NeoMarker公司；②MyoD單克隆抗體購自美國BD公司；③Wnt1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；④免疫組化UltraSensitiveTMSp超敏試劑盒(產(chǎn)品編號kit-9701，kit-9709)，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；⑤逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自

6、大連寶生物工程有限公司；⑥乙烯硫脲Ethylenethiourea，ETU(C3H6N2S，Lot：S24419-426)購自Sigma-Aldrich德國公司。 實(shí)驗(yàn)方法： 在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天(E10)，按125mg/kg經(jīng)胃管給予ETU(濃度為1％，以生理鹽水做溶劑)，制作ARMs大鼠動物模型，對照組給予等量的生理鹽水。分別在大鼠E13、E13.5、E14、E14.5、E15、E16、 E17、

7、E18和E21剖宮取胎，在解剖顯微鏡下獲取盆部標(biāo)本，另取正常出生后1周、2周、4周的幼鼠和成鼠直腸肛管及周圍組織標(biāo)本。一部分標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定、脫水后制成蠟塊，行矢狀面、橫斷面和冠狀面的連續(xù)切片，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：①H&E染色及MyoD和Myogenin免疫組化染色，以其作為胚胎期骨骼肌的特異性標(biāo)志物，觀察正常和ARMs大鼠SMC和EAS在胚胎期的形態(tài)學(xué)變化過程。②進(jìn)行Wnt1、MyoD、Myogenin的免疫組化染色，

8、通過測定陽性反應(yīng)的平均光密度值(average optical density，AOD)來比較Wnt1、MyoD、Myogenin這些肌肉發(fā)生相關(guān)因子在盆底肌的表達(dá)情況。③進(jìn)行α-SMA的免疫組化染色，以其作為胚胎期消化道平滑肌的標(biāo)志物，觀察正常和ARMs大鼠后腸平滑肌的形態(tài)發(fā)育過程；同時比較α-SMA蛋白在兩組標(biāo)本后腸的表達(dá)情況。另一部分標(biāo)本通過顯微切割取材獲得盆底肌和后腸標(biāo)本，盆底肌標(biāo)本進(jìn)行Wnt1、MyoD、Myogenin mR

9、NA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，后腸標(biāo)本進(jìn)行α-SMA mRNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用G：BOX SYNGENE凝膠分析系統(tǒng)拍照，Koda Digital Science1.0DNA分析軟件進(jìn)行半定量分析。所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，差異比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行各胎齡正常組與ARMs組的配對t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： (1)在正常及ARMs大鼠胚胎，在E15，有散在的SMC肌前體細(xì)胞出現(xiàn)在會

10、陰區(qū)；可于E16觀察到SMC肌纖維樣結(jié)構(gòu)；ARMs大鼠胚胎的SMC在E16時，其位置、形態(tài)及走行與正常組無明顯差異，從E18起，可觀察到發(fā)育異常的SMC，SMC的胚胎形態(tài)學(xué)改變晚于畸形的肛門直腸的發(fā)生。 (2)EAS于E17時出現(xiàn)，在胚胎期發(fā)育較緩慢，出生后生長迅速，在出生后4周完成定向生長，最終與IAS和直腸縱肌共同形成肌復(fù)合體包繞肛管，畸形組EAS胚胎發(fā)育過程中，位于肛凹上方，排列走形紊亂。 (3)E14～E16，W