心肌梗死后轉(zhuǎn)染VEGF-,165-基因的自體骨胳肌成肌細(xì)胞移植治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：成肌細(xì)胞移植在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和Ⅰ期臨床試驗(yàn)中已證實(shí)可改善梗死后的心室功能，其具體機(jī)制尚未闡明，但普遍認(rèn)為植入細(xì)胞的存活數(shù)量與心功能改善程度密切相關(guān)。我們?cè)O(shè)想聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞移植治療和基因血管治療：以脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染入兔自體骨胳肌成肌細(xì)胞后移植于兔心肌梗死區(qū)，使經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的VEGF165基因促毛細(xì)血管生成作用能適度的，適時(shí)的表達(dá)。以期證明轉(zhuǎn)基因后的成肌細(xì)胞移植能更好的改善心梗區(qū)的血供，提高移植細(xì)胞的存活率，從而較單純的細(xì)胞移

2、植治療能更好的改善心功能。 方法：第一部分：體外分離、純化、培養(yǎng)及鑒定新西蘭兔成肌細(xì)胞，并利用pcDNA3.1-EGFP真核表達(dá)載體優(yōu)化出脂質(zhì)體LipofectamineTM2000體外轉(zhuǎn)染新西蘭兔成肌細(xì)胞的最佳條件，以用于目的基因VEGF165的轉(zhuǎn)染。 第二部分：將pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒用脂質(zhì)體導(dǎo)入新西蘭兔自體成肌細(xì)胞中，通過(guò)RT-PCR、Westen-blot和ELISA在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)VE

3、GF165在成肌細(xì)胞中的體外強(qiáng)度和時(shí)限。 第三部分：在新西蘭兔心肌梗死后2周，分別將轉(zhuǎn)染VEGF165的成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液注入各組的心肌梗死區(qū)，4周后觀察心功能改善情況，心梗邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度及植入細(xì)胞的鑒定。 結(jié)果：第一部分：體外培養(yǎng)可獲得純度為85.4±6.7％Desmin陽(yáng)性的成肌細(xì)胞，優(yōu)化條件后脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可獲得31.7±3.4％的轉(zhuǎn)染率。 第二部分：轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條

4、大小約600bp的特異性泳帶，測(cè)序結(jié)果與VEGF165mRNA一致。Westernblot檢測(cè)到大小為23KD的特異性蛋白質(zhì)條帶。ELISA顯示體外培養(yǎng)的VEGF165轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞可持續(xù)1周左右強(qiáng)度為103.72±8.10ng/ml的蛋白分泌量。 第三部分：轉(zhuǎn)染VEGF165的成肌細(xì)胞移植組，成肌細(xì)胞移植組和對(duì)照組超聲心功能指標(biāo)比較(LVESV1.02±0.17ml，1.30±0.18mlVs1.50±0.19ml，P＜0.0

5、5；LVEDV4.44±0.47ml，5.01±0.53mlVs5.55±0.51ml，P＜0.05；EF68.41±7.77％，57.76±7.15％Vs42.55±5.78％，P＜0.05)顯示轉(zhuǎn)染VEGF165的成肌細(xì)胞移植組心功能顯著改善。以上三組心梗邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度的比較(31.53±7.88個(gè)/200倍視野，12.17±2.66個(gè)/200倍視野Vs3.02±0.68個(gè)/200倍視野，P＜0.05)顯示轉(zhuǎn)染VEGF165的成

6、肌細(xì)胞移植組的心梗邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度最大。免疫組化證實(shí)植入的成肌細(xì)胞為肌源性，但與心肌細(xì)胞間未觀察到任何形式的連接。 結(jié)論：1.采用反復(fù)差速貼壁法培養(yǎng)可在體外獲得大量高純度的骨骼肌成肌細(xì)胞。 2.陽(yáng)離子脂質(zhì)體法能介導(dǎo)pcDNA3.1-VEGF165質(zhì)粒在體外培養(yǎng)的兔成肌細(xì)胞中可持續(xù)1周較高強(qiáng)度的VEGF165蛋白分泌。 3.植入的肌源性成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞無(wú)直接聯(lián)系。 4.轉(zhuǎn)染VEGF165的成肌細(xì)胞移植組