骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死后心力衰竭的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：充血性心力衰竭是心肌梗死后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，以往的治療手段尚不能使受損的心肌細(xì)胞得到有效的修復(fù)。干細(xì)胞技術(shù)的研究發(fā)展表明，骨髓細(xì)胞移植有可能成為治療這類病人的全新方法。但是，以往的研究應(yīng)用的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞都是通過(guò)培養(yǎng)得到的，因此這種細(xì)胞仍存在純度不高、表現(xiàn)不均一、不利于移植后的分化鑒定等缺點(diǎn)，因此有必要對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行改建。供體細(xì)胞種類不同，引起的心功能改善程度也不一致，何者是移植的最佳供體細(xì)胞，目前并無(wú)比較研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的

2、供體細(xì)胞多為人源骨髓干細(xì)胞，多為異種移植，這種異種移植是否會(huì)影響其療效呢?供體干細(xì)胞的改建是影響骨髓干移植療效的主要因素。但是，由于心臟自身的血流灌注狀態(tài)對(duì)心梗后骨髓干細(xì)胞移植的療效可能也有較大影響，改善供體所在微環(huán)境也可能是提高其療效的關(guān)鍵。本研究旨在探討：(1)從培養(yǎng)的人源骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分選、純化、擴(kuò)增得到純化均一的多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞；(2)觀察這些細(xì)胞移植在梗死心肌中對(duì)血管新生和心臟功能改善的效果；(3)與目前常用的其他供體細(xì)胞比

3、較，觀察經(jīng)純化的骨髓干細(xì)胞移植是否更有利于心臟功能改善；(4)通過(guò)觀察純化的骨髓干細(xì)胞移植后引起缺血心肌中與排斥反應(yīng)密切相關(guān)的基因HO-1表達(dá)情況，探討HO-1與異種移植人源MMSCs到梗死大鼠心臟引起的效應(yīng)之間相互關(guān)系；(5)通過(guò)觀察梗死區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立對(duì)冠脈內(nèi)骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植術(shù)心肌修復(fù)療效的影響，探討受體心臟微環(huán)境對(duì)供體細(xì)胞功能的影響。 方法：利用大鼠急性心肌梗死模型和小型豬慢性心肌缺血模型，通過(guò)心外膜直視下注射或經(jīng)冠狀動(dòng)

4、脈內(nèi)注射方式移植骨髓干細(xì)胞。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化；冠脈造影顯像評(píng)估側(cè)枝循環(huán)情況；組織病理學(xué)顯示心室膠原含量的變化；免疫組化法顯示新生血管數(shù)量、移植細(xì)胞的可塑性情況、宿主心肌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)和歸巢因子(SDF-1)的表達(dá)情況；RT-PCR、Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)這些細(xì)胞因子或細(xì)胞蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：第一部分內(nèi)容，通過(guò)制備大鼠心

5、肌梗死模型，采用通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)與流式分選雙結(jié)合的方法，從培養(yǎng)的人源骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分選、純化、擴(kuò)增均一換多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞(MultipotentMesenchymalStemCells，MMSCs)，同時(shí)對(duì)其特征進(jìn)行鑒定，分析其體外和在體的分化能力，觀察這些細(xì)胞移植在梗死心肌中對(duì)血管新生和心臟功能改善的效果。結(jié)果表明：1.MMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD44、CD90和CD147，陰性表達(dá)CD34、CD38、CD45、CD71、CD117、CD10

6、6和HLR-DR，并表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白(Oct4，Bmil和ABCG2)，分泌VEGF，5-aza可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化；而成纖維細(xì)胞雖然陽(yáng)性表達(dá)CD44、CD90和CD147，但并不表達(dá)Oct4，Bmil和ABCG2，不分泌VEGF，不能被5-aza誘導(dǎo)向心肌細(xì)胞分化。2.與成纖維細(xì)胞移植或注射鹽水組比較，移植MMSCs明顯促進(jìn)梗死心臟VEGF表達(dá)(mRNA和蛋白水平)，也顯著增加缺血心肌血管新生。3.免疫熒光檢測(cè)顯示VEGF

7、表達(dá)在移植的MMSCs和受體心肌細(xì)胞均表達(dá)。4.激光共聚焦顯微鏡顯示移植的MMSCs在移植后14天表達(dá)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞特征性蛋白。 第二部分內(nèi)容，應(yīng)用磁珠分選和極限稀釋細(xì)胞培養(yǎng)方法獲取人源骨髓單克隆間充質(zhì)干細(xì)胞(snMSCs)，利用貼壁培養(yǎng)方法得到未純化的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(uMSCs)，利用梯度密度離心法得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)。流式細(xì)胞儀分析所得細(xì)胞特性后，將其移植到梗死心臟。術(shù)

8、后90天，應(yīng)用血流動(dòng)力學(xué)技術(shù)檢測(cè)大鼠心臟功能，隨后取材，免疫熒光檢測(cè)移植細(xì)胞的分化情況和血管密度。結(jié)果顯示：1.snMSCs呈99％以上表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白，陰性表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記蛋白。2.移植snMSCs心臟收縮功能較明顯高于其它各組(P＜0.05)。血管計(jì)數(shù)顯示，snMSC組血管密度明顯多于其它各組(P＜0.05)。3.移植的snMSCs向心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率明顯高于其它骨髓細(xì)胞(P＜0.05)，外周血細(xì)胞并不發(fā)現(xiàn)分化。

9、 第三部分內(nèi)容，通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備大鼠心肌梗死模型，直視下心外膜注射5×106MSCs或等量PBS溶液；利用免疫熒光、Westernblot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HSP32在術(shù)后1d、3d和7d的表達(dá)變化情況。組織學(xué)檢測(cè)梗死面積。熒光顯微鏡下觀察DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，流式細(xì)胞儀分析從心臟中分離出來(lái)的DAPI陽(yáng)性細(xì)胞含量。通過(guò)超聲心動(dòng)圖分析心臟功能(EF值和FS值)。結(jié)果顯示：1.缺血心肌中HSP32的表達(dá)在移植

10、組明顯增強(qiáng)，并表達(dá)于部分移植細(xì)胞內(nèi)。2.移植組HSP32表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，術(shù)后3天達(dá)到高峰，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。術(shù)后7天，移植組EF值和FS值明顯高于同期對(duì)照組(14％和22％，P＜0.05)。3.HO-1表達(dá)上調(diào)同時(shí)伴隨DAPI陽(yáng)性MSCs數(shù)量增加，心肌梗死減少，和缺血心臟功能改善。 第四部分內(nèi)容，結(jié)扎豬心臟左前降支以建立心梗模型，心梗后2周，對(duì)模型豬進(jìn)行梗死區(qū)側(cè)枝循環(huán)Rentrop評(píng)分，取分值為

11、0(R0)或1(R1)的模型豬各10頭，心內(nèi)膜下活檢后，然后行冠脈內(nèi)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(2×108cells)移植(BMT)治療，以冠脈內(nèi)注射PBS作對(duì)照。即分為R0+BMT、R0+PBS、R1+BMT、R1+PBS共4組，每組各5頭心梗模型豬。結(jié)果表明：1.兩周時(shí)，從梗死區(qū)和梗死周邊活檢組織顯示，R1組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和歸巢因子(SDF-1)表達(dá)量明顯高于R0組。R1組血管密度也明顯多于R0

12、組。2.梗死后6周，R1+BMT組Rentrop分值顯著升高，心超檢查發(fā)現(xiàn)R0+BMT、R1+BMT兩組射血分?jǐn)?shù)(EF)和心肌縮短分?jǐn)?shù)(FS)均明顯提高，而以R1+BMT組最顯著。3.與心功能檢測(cè)和Rentrop評(píng)分結(jié)果變化相一致，心梗后6周的血管新生數(shù)量增加、VEGF和bFGF表達(dá)量在R1+BMT組是最明顯的。 結(jié)論： 1.從人骨髓分離得到的純化MMSCs可上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管新生和提高梗死大鼠心臟功能恢復(fù)。