RNA干擾VEGF及其受體對缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖的研究.pdf

1、血管增殖性視網(wǎng)膜病變是一類以視網(wǎng)膜新生血管形成和纖維增殖為特征的常見致盲眼病，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管炎、伴有高血壓的視網(wǎng)膜靜脈阻塞等疾病。目前研究認為缺血和/或缺氧引起新生血管刺激因子和抑制因子之間失去平衡，從而導(dǎo)致新生血管形成，而血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是最重要的新生血管刺激因子。目前對這類疾病的治療以激光和手術(shù)為主，主要治療并發(fā)癥，但

2、療效欠佳，不能從根本上治療新生血管。而藥物治療的效率和選擇性較低，全身給藥時藥物不僅作用于眼球，也作用于全身其它的器官組織，引起全身的副作用。因此尋找一種高效、特異和具有靶向性的技術(shù)來抑制新生血管是我們解決問題的關(guān)鍵。RNA干擾是一種高效的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，其最大優(yōu)點是高效性和高特異性。因此本實驗以缺氧誘導(dǎo)的血管增殖性視網(wǎng)膜病變的動物模型為研究對象，以選擇性PEI-PEG-RGD載體介導(dǎo)的VEGF和其受體VEGFR特異性的

3、RNA干擾為干預(yù)方法，以熒光素灌注和視網(wǎng)膜平鋪片、冰凍切片和組織化學染色、RT-PCR、ELISA為主要結(jié)果測量指標，探討RNA干擾VEGF及VEGFR-1，VEGFR-2基因的表達對視網(wǎng)膜新生血管的影響，為血管增殖性視網(wǎng)膜病變的治療尋找新方法。 目的：研究RNA干擾VEGF及其受體VEGFR-1，VEGFR-2對缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖的作用。 方法：設(shè)計和合成以VEGF及其受體為靶基因的小分子干涉RNA(smal

4、linterfaceRNA，siRNA)(稱為siMix)，針對熒光素酶(luciferase)的siRNA(稱為siLuc)作為對照。將鼠齡為7天(Postnatal7，P7)的C57BL/6J幼鼠置于體積分數(shù)為75％的氧氣箱中連續(xù)飼養(yǎng)5天，建立氧誘導(dǎo)的血管增殖性視網(wǎng)膜病變模型。在P12將幼鼠放回正常大氣環(huán)境中飼養(yǎng)，在P12和P13分別經(jīng)結(jié)膜下、玻璃體腔和腹腔注射聯(lián)合載體的siMix和siLuc。其中局部注射時一眼注射siMix，另一

5、只眼注射siLuc。P17取鼠眼做冰凍切片和生物素標記的凝集素(griffoniasimplicifolialectinB4，GSA)染色或熒光素灌注后做視網(wǎng)膜平鋪片，定量計算視網(wǎng)膜新生血管的面積；同時用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)分別檢測P14和P

6、17視網(wǎng)膜VEGF及VEGFR-1、VEGFR-2的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。 結(jié)果：玻璃體腔和腹腔注射siLuc組與注射siMix組比較：視網(wǎng)膜平鋪片檢測的視網(wǎng)膜新生血管面積分別從(0.310±0.069)mm2/眼，(0.649±0.200)mm2/眼降到(0.129±0.050)mm2/眼，(0.312±0.129)mm2/眼；冰凍切片檢測的新生血管的面積分別從(0.272±0.084)mm2/眼，(0.314±0.079

7、)mm2/眼降到(0.182±0.057)mm2/眼，(0.164±0.047)mm2/眼(所有p＜0.05)。結(jié)膜下注射兩組新生血管面積未見明顯差異(p＞0.05)。玻璃體腔注射siMix后P17視網(wǎng)膜表達VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2蛋白水平較對照組分別減少24％，22％，17％；腹腔注射后分別減少17％，19％，15％，而兩種給藥方式并無明顯差別。P17視網(wǎng)膜表達VEGF、VEGFR-1及VEGFR-2的mRNA水平也較

8、對照組明顯降低(p＜0.01)。 結(jié)論：針對VEGF及其受體的多位點RNA干擾技術(shù)可以雙重阻斷VEGF及VEGF的受體，可以較大程度的抑制缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖，在mRNA和蛋白水平降低視網(wǎng)膜表達VEGF及VEGFR-1，VEGFR-2，證實了VEGF在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)病機制中的作用，阻斷VEGF是一有效的治療途徑。腹腔注射聯(lián)合載體的siRNA能將siRNA靶向輸送到視網(wǎng)膜新生血管組織，抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，達到局部治療