VEGF小干擾RNA抑制視網(wǎng)膜新生血管的研究.pdf

1、目的: 視網(wǎng)膜新生血管性疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變，缺血性視網(wǎng)膜靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等均會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）是視網(wǎng)膜新生血管形成最主要的生長(zhǎng)因子。抑制VEGF的表達(dá)，可以減少視網(wǎng)膜新生血管的形成。本文采用RNA干擾技術(shù)，從分子水平抑制VEGF的表達(dá)。研究的目的是構(gòu)建VEGFsiRNA的表達(dá)質(zhì)粒，以小鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變新生血管

2、動(dòng)物模型為研究對(duì)象，探討VEGF小干擾RNA（VEGFsiRNA）對(duì)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用，評(píng)價(jià)其治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的效果。 方法: 本研究包括4部分： 1.分別設(shè)計(jì)針對(duì)猴和小鼠的VEGF小干擾RNA，以pSilencer2.1-U6neo為質(zhì)粒載體，構(gòu)建VEGFsiRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切、測(cè)序鑒定。 2.體外培養(yǎng)的猴視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分成常氧組和二氯化鈷缺氧

3、組。缺氧組中，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（LF2000）介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒（空載體組）和VEGFsiRNA表達(dá)質(zhì)粒（VEGFsiRNA轉(zhuǎn)染組），缺氧組中未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為缺氧對(duì)照組。常氧組細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染，為正常組。采用MTT法觀察細(xì)胞增殖，real-timeRT-PCR檢測(cè)VEGFmRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)。 3.改良的Smith方法建立氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變模型，采用HE染色、

4、FITC-Dextran熒光造影視網(wǎng)膜鋪片觀察視網(wǎng)膜新生血管的形態(tài)變化，real-timeRT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中VEGFmRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 4.C57BL/6J小鼠分為四組。常規(guī)空氣中飼養(yǎng)小鼠為正常組，氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜病變小鼠隨機(jī)分為缺氧對(duì)照組、空載體組和基因治療組，正常組和缺氧對(duì)照組小鼠不做處理，空載體組和基因治療組分別以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（LF2000）介導(dǎo)玻璃體腔內(nèi)注射空載體質(zhì)粒和VEGFsi

5、RNA表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)果: 1.將合成的DNA序列退火后克隆到載體上，并做測(cè)序分析，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定確定為所需序列。 2.MTT法細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h、48h、72h生長(zhǎng)曲線顯示VEGFsiRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較其他各組細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。real-time RT-PCR和Western blot顯示細(xì)胞VEGFmRNA及蛋白水平：正常組細(xì)胞僅見(jiàn)弱的VEGFmRNA和蛋白表達(dá)，而缺氧對(duì)照組表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.0

6、1），空載體轉(zhuǎn)染組表達(dá)與缺氧對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），VEGFsiRNA轉(zhuǎn)染組較缺氧對(duì)照組減弱（P<0.01），VEGFmRNA和蛋白抑制率分別為48.07%、51.82%。 3.氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜新生血管在P14開(kāi)始出現(xiàn)，P17達(dá)高峰，以后逐漸下降。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中VEGFmRNA在P12表達(dá)較低，P14達(dá)高峰，以后逐漸下降。 4.病理切片顯示正常組很少見(jiàn)到突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核，而對(duì)

7、照組和空載體組中則可見(jiàn)到大量突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞核，發(fā)生率為100%，基因治療組較缺氧對(duì)照組和空載體組明顯減少。免疫熒光染色顯示正常組VEGF呈弱陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組和空載體組VEGF表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，基因治療組VEGF表達(dá)明顯減少。real-time RT-PCR顯示正常組視網(wǎng)膜VEGFmRNA中僅見(jiàn)弱的VEGFmRNA表達(dá)，而缺氧對(duì)照組表達(dá)上調(diào)（P<0.01），空載體組表達(dá)與缺氧對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），基因治療組較