羊膜提取液抑制視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究.pdf

1、視網(wǎng)膜新生血管形成是許多視網(wǎng)膜疾病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞以及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等)視功能受損甚至失明的主要原因。由于視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)病機制尚未明確，臨床上缺乏理想的治療方法。因此，人們一直在研究視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)病機制及其治療方法。羊膜是胎盤最內(nèi)層組織，近年來，羊膜移植在眼表疾病治療中應(yīng)用廣泛，臨床已證實羊膜移植有抑制新生血管的作用，但無任何實驗研究顯示其對視網(wǎng)膜新生血管形成是否有預(yù)防和治療作用。因此，本研究首次將羊膜制

2、備成不同濃度的提取液，用于氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，采用組織病理學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)方法、Western免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附方法觀察其對視網(wǎng)膜新生血管的抑制情況，并探討其作用機制。 第1章可定量的氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型的建立目的建立可對視網(wǎng)膜新生血管進行定量研究的動物模型，為研究視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生機制及治療提供實驗基礎(chǔ)。 方法將32只鼠齡7天C57BL/6J新生小鼠放在濃度為(75±2)％的高氧狀態(tài)下生活

3、5天，然后回到正常氧環(huán)境下，作為氧誘導(dǎo)模型組；另32只同日齡新生小鼠置于正?？諝猸h(huán)境中生活，作為正常對照組。兩組小鼠分別在出生后12、14、17、24天處死，摘除眼球，熒光素血管灌注法視網(wǎng)膜鋪片了解氧所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管改變；出生后17天小鼠進行組織病理學(xué)及光鏡觀察，計數(shù)矢狀面6μm視網(wǎng)膜切片中突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)，反映視網(wǎng)膜血管的增生情況。 結(jié)果1.熒光素血管灌注法視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果：實驗組新生鼠的視網(wǎng)膜血管在高氧環(huán)境中生長

4、5天后，視網(wǎng)膜血管收縮、閉塞，出現(xiàn)大片無血管灌注區(qū)；回到正?？諝猸h(huán)境下2天后，視網(wǎng)膜開始出現(xiàn)新生血管；回到空氣中5天后，視網(wǎng)膜新生血管形成達到高峰，回到空氣中12天后，視網(wǎng)膜新生血管消退。 2.視網(wǎng)膜切片結(jié)果：突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞數(shù)，氧誘導(dǎo)的模型組為(22.56±10.45個)，對照組(1.23±1.14個)，二者相比差異有顯著意義(p＜0.001)。 結(jié)論該動物模型可重復(fù)性高，并可進行定量研究，是進行視網(wǎng)膜新

5、生血管發(fā)生機制和藥物治療的合適模型。 第2章視網(wǎng)膜新生血管中細胞因子表達的實驗研究目的分析氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管動物模型細胞調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)規(guī)律，探討視網(wǎng)膜新生血管形成的可能機制。 方法將54只鼠齡7天C57BL/6J新生小鼠在濃度為(75±2)％的高氧狀態(tài)下生活5天，然后回到正常氧環(huán)境下，作為氧誘導(dǎo)模型組；另54只同日齡新生鼠置于正常空氣環(huán)境中生活，作為正常對照組。兩組小鼠60只分別在出生后12、14、17天處死，取出雙眼

6、眼球，進行Western免疫印跡法進行血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)的測定；兩組小鼠48只分別在出生后17天處死，取出雙眼眼球，用免疫組織化學(xué)染色、酶聯(lián)免疫吸附法進行核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、白介素1-β(IL-1B)的測定。 結(jié)果1.Western免疫印跡法結(jié)果(1)新生小鼠出生12天時，VEGF的蛋白水平在對照組視網(wǎng)膜中表達最強，與第14天和第17天比較，表達強度差異均有顯著意義(p＜0.01))

7、；高氧組12天時與對照組比較，VEGF表達明顯減弱，統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著意義(p＜0.001)；而高氧組14天VEGF表達增強，與對照組比較，差異有顯著意義(p＜0.001)；而高氧組17天時VEGF表達進一步增強，與對照組比較，差異有顯著性(p＜0.01)，與高氧組第12天、第14天比較，表達強度差異均有顯著性(p＜0.01)。 (2)出生12天時，新生小鼠PEDF的蛋白水平在對照組視網(wǎng)膜中表達最弱，與第14天和第17天比較，

8、表達強度差異均有顯著意義(p＜0.01)；高氧組12天時PEDF與對照組比較表達明顯增強，統(tǒng)計學(xué)處理差異有顯著意義(p＜0.001)；而高氧組14天PEDF表達下降，與對照組比較，差異有顯著意義(p＜0.05)；而高氧組17天時PEDF表達進一步下降，與對照組比較，差異有顯著性(p＜0.05)，與高氧組第12天、第14天比較，表達強度差異均有顯著性(p＜0.01)。 2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果實驗組可見NF-κB陽性細胞，正常對照

9、組未見NF-κB陽性細胞。 3.酶聯(lián)免疫吸附法結(jié)果實驗組NF-κB的蛋白水平比對照組升高(p＜0.001)；IL-1β的蛋白水平(10.02±比對照組升高(p＜0.01)。 結(jié)論視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)鍵是血管促進因子與血管抑制因子之間平衡失調(diào)，在缺氧等病理因素影響下主要是由于VEGF上調(diào)PEDF下調(diào)所引起的；NF-κB參與了新生血管的形成過程。 第3章羊膜提取液抑制鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的實驗研究目的觀察羊膜提取液

10、抑制氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的效果，探討其作用機制。 方法將鼠齡7天的C57BL/6J小鼠265只隨機分為5組。正常對照組于空氣中飼養(yǎng)，不予任何處理；其他4組置于氧箱中飼養(yǎng)。實驗組分別于鼠齡12、14天時，玻璃體腔注射不同濃度的羊膜提取液(1.8mg/ml；1.0mg/m1)2μl/d，實驗對照組玻璃體腔注射等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，氧動物模型組不注射羊膜提取液。在鼠齡17天時將小鼠處死，熒光素灌注—視網(wǎng)膜鋪片檢測視網(wǎng)膜無血管

11、灌注區(qū)面積；光鏡下計數(shù)突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核數(shù)反應(yīng)羊膜提取液抑制新生血管形成的作用；Western免疫印跡檢測VEGF、PEDF的表達；酶聯(lián)免疫吸附法檢測NF-κB、IL-1β的表達；視網(wǎng)膜組織切片用NF-κB進行免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果1.視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果正常對照組未見視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)，氧動物模型組和實驗對照組可見大量無灌注區(qū)，而實驗組明顯少于高氧組和正常對照組(p＜0.01)。 2.視網(wǎng)膜切片結(jié)果正常對照組HE染色幾

12、乎未見突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，氧動物模型組和實驗對照組可見較多內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核，而實驗組數(shù)目明顯少于高氧組和正常對照組(p＜0.01)。 3.Westernblot檢測結(jié)果各組均可見VEGF表達，實驗組VEGF表達較氧動物模型組和實驗對照組明顯下降。各組均可見PEDF表達，實驗組PEDF表達較氧動物模型組和實驗對照組明顯升高。 4.免疫組織化學(xué)法正常對照組未見NF-κB陽性細胞，氧動物模型組和實驗對照組可