Kringle1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究.pdf

1、目的 建立高氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型，觀察動物模型視網(wǎng)膜新生血管的形成、發(fā)展及消退情況；在此基礎上，觀察不同濃度的Kringle 1-5對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用及在新生血管形成不同時期應用時作用的差別，并檢測用藥后小鼠視網(wǎng)膜血管內皮細胞的凋亡情況，以探討Kringle 1-5抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用機制。 材料和方法 一、高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型的建立與觀察1．動物模型的建立健康C57B

2、L/6J新生小鼠24只，性別不限，隨機分為高氧模型組與正常對照組，每組12只(24眼)。高氧模型組小鼠于生后7天與同籠的一只母鼠一起進入塑料制作的密閉氧箱，另選生育有同齡幼鼠的母鼠生活在正常大氣環(huán)境中做替換母鼠。氧箱內通入85％的濕潤氧氣，每日檢測氧濃度3～4次，維持氧箱內氧氣的體積分數(shù)為(75±2)％。每天一次打開氧箱加食、換水、替換母鼠，5天后將小鼠返回正常大氣環(huán)境中。正常對照組小鼠普通大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。所有小鼠均于自然光照明下飼養(yǎng)，

3、溫度控制在23℃±2℃。 2．視網(wǎng)膜新生血管的觀察于小鼠生后15、17、19、21、24、30天時，分別取高氧模型組和正常對照組各2只小鼠(4眼)，麻醉后經(jīng)上腔靜脈注射2％伊文思藍(Evans blue)溶液，待循環(huán)5分鐘后處死小鼠，摘取眼球，置4％多聚甲醛固定。固定3小時后分離視網(wǎng)膜并鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管情況。 二、Kringle 1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究1．不同濃瘦的Kringle 1-5對

4、視網(wǎng)膜新生血管形成的影響健康C57BL/6J新生小鼠60只，性別不限，隨機分為正常對照組、高氧對照組、0.1μg治療組、0.5μg治療組、2.5μg治療組和5μg治療組，每組10只。正常對照組新生小鼠正常大氣環(huán)境飼養(yǎng)；高氧對照組及各治療組小鼠制作視網(wǎng)膜新生血管動物模型。高氧對照組于小鼠生后12天時右眼玻璃體腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)1μg，0.1μg治療組、0.5μg治療組、2.5μg治療組和5μg治療組分別于小鼠生后12天時右眼玻璃

5、體腔內注射濃度為0.1μg/μl、0.5μg/μl、2.5μg/μl和5μg/μl的Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于術后5天(即出生后17天)觀察小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成情況，觀察項目有： (1) 伊文思藍視網(wǎng)膜血管造影(每組4眼)：2％伊文思藍小鼠上腔靜脈注射，處死后取眼球固定，分離視網(wǎng)膜進行鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管情況并照相； (2) 組織學檢查及血管內皮細胞計數(shù)(每組6眼)：處死動物摘取眼球，常規(guī)組織

6、固定，石蠟包埋，連續(xù)組織切片，蘇木素．伊紅(HE)染色，每隔90μm取一張切片，含視乳頭的切片棄去，光鏡下觀察計數(shù)突破內界膜的內皮細胞核，即新生血管內皮細胞，定量分析比較。 2．在視網(wǎng)膜新生血管形成不同時期應用Kringle 1-5根據(jù)前述研究得出的最低有效濃度，確定藥物劑量為0.1μg。取健康C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組、高氧對照組、P12治療組和P17治療組。正常對照組于正常大氣中飼養(yǎng)，高氧對照組及治療組制作成高氧

7、誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型，P12治療組于生后12天時右眼玻璃體腔注射0.1，∥g似llKringle 1—5蛋白溶液1μl，P17治療組于生后17天時右眼玻璃體腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后21天時觀察小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成情況，觀察項目同前。 3．Kringle 1-5對視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡情況影響的檢測取健康C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組、高氧對照組和P17治療組，P1

8、7治療組于生后17天時右眼玻璃體腔注射0.1μg/μl Kringle 1-5蛋白溶液1μl。于生后18、19、20、21天時，取三組小鼠各一只處死，摘除眼球快速凍存，制成冰凍切片。應用TUNEL法原位檢測凋亡的細胞，同時應用對血管內皮細胞特異性的免疫熒光標志CD31雙染來識別血管內皮細胞，凋亡細胞中有CD31顯色的即為凋亡的血管內皮細胞。觀察比較各組中凋亡的血管內皮細胞數(shù)量。結果一、高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管動物模型所有高氧誘導模型小

9、鼠均出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管生成反應。視網(wǎng)膜鋪片伊文思藍灌注造影可以清楚、完整的顯示小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中視網(wǎng)膜血管無灌注區(qū)、血管滲漏、新生血管形成等視網(wǎng)膜血管病變。 正常小鼠在生后15、17、21、24、30天視網(wǎng)膜血管分布均勻，無異常改變。高氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜在生后15天出現(xiàn)大量的無灌注區(qū)，伴血管迂曲擴張、滲漏、新生血管及微動脈瘤形成，在生后17天時新生血管生成反應達到高峰，生后24天開始退縮，至生后30天時基本恢復正常。

10、 二、Kringle 1-5抑制小鼠視網(wǎng)膜新生血管的實驗研究 1．不同濃度的Kringle 1-5對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響伊文思藍灌注造影顯示0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringle 1-5蛋白溶液玻璃體腔注射組小鼠視網(wǎng)膜新生血管顯著減少，血管滲漏減輕，無灌注區(qū)仍然可見。 石蠟切片HE染色顯示，正常對照組、高氧對照組、0.1μg、0.5μg、2.5μg和5μg的Kringlel-5治療組平均每眼突破

11、內界膜的血管內皮細胞計數(shù)分別為0.20±0.15、36.70±21.23、10.80±9.07、9.60±7.41、8.52±7.70和8.71±6.62。各治療組與高氧對照組、正常對照組之間比較，差異均具有顯著性意義(P<0.01)，各治療組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 2．Kringle 1-5對視網(wǎng)膜新生血管形成不同階段的作用伊文思藍灌注造影顯示在生后21天時P12治療組和P17治療組視網(wǎng)膜新生血管較高氧對照組

12、明顯減少，其中以P12治療組減少更為顯著。 石蠟切片HE染色顯示，正常對照組、高氧對照組、P12治療組和P17治療組在生后21天時平均每眼突破內界膜的血管內皮細胞計數(shù)分別為0.09±0.05、19.22±9．85、2.04±1.16、7.88±3.89，各組之間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 3．Kringlel-5對視網(wǎng)膜血管內皮細胞凋亡情況影響的檢測在高氧組和Kringle 1-5治療組均可見到成簇的CD3

13、1標記的血管內皮細胞，治療組與高氧對照組相比凋亡的血管內皮細胞情況未見明顯差異。 結論 1．伊文思藍灌注造影可以清楚的顯示高氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型視網(wǎng)膜血管形態(tài)改變。 2．高氧誘導的C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，在生后15天時新生血管已經(jīng)開始形成，并在生后17天時達到高峰，生后24天開始逐漸退縮，生后30天時基本恢復正常。 3．在高氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中，0.1μg、0.5μg、