藤黃酸對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管新生的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:藤黃屬植物一般生長(zhǎng)在熱帶地區(qū)，以喬木和灌木居多。藤黃屬植物以其普遍含有多種藥理活性而著稱。其藥用成分藤黃自古以來(lái)就一直被廣泛用于治療炎癥、腫物等疾病。藤黃包含很多成分，如藤黃酸、別藤黃酸、異藤黃酸、新藤黃酸等等，藤黃酸（Gambogic Acid，GA;C38H44O8;分子量628.75）正是藤黃主要的活性單體成分之一。藤黃酸具有抗腫瘤作用，可以在體內(nèi)和體外抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，并且可以使毒副作用最小化，從而減輕對(duì)免疫系統(tǒng)和造血系

2、統(tǒng)的毒性，已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。除此之外，藤黃酸還具有抗感染、抗氧化、抗病毒等多種作用。
　　糖尿病性視網(wǎng)膜病變，是由于糖尿病發(fā)展過程中長(zhǎng)期高血糖引起的一種慢性微血管并發(fā)癥，是糖尿病的一種常見的、極為嚴(yán)重的并發(fā)癥。三分之一以上的糖尿病患者伴有視網(wǎng)膜病變。很多糖尿病患者因?yàn)橐暰W(wǎng)膜病變而引起視力下降、甚至視力完全喪失，從而嚴(yán)重影響生活的質(zhì)量。糖尿病性視網(wǎng)膜病變主要分為早期非增殖性視網(wǎng)膜病變和晚期增殖性視網(wǎng)膜病變兩

3、大階段。其中增殖性視網(wǎng)膜病變的標(biāo)志是視網(wǎng)膜血管新生，而新生血管系統(tǒng)的脆弱和滲漏會(huì)引起視網(wǎng)膜的一系列不可逆損傷，最終導(dǎo)致失明。在糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管新生過程中，HIF-1α、VEGF、iNOS的產(chǎn)生起到重要的作用，而與其相關(guān)的信號(hào)通路包括p38MAPK和PI3K/AKT。因此，我們?cè)诒狙芯恐袑?duì)主要應(yīng)答于缺氧條件的PI3K/AKT信號(hào)通路，及其引起的HIF-1α、VEGF的變化進(jìn)行了研究。
　　我們希望能過通過研究證明藤黃酸對(duì)糖尿病

4、性視網(wǎng)膜病變的治療作用。本研究大體分為三部分:首先，我們通過STZ誘導(dǎo)建立小鼠糖尿病模型，進(jìn)行體內(nèi)研究，觀察藤黃酸治療是否能減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管新生。并檢測(cè)視網(wǎng)膜血管新生及血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。之后，我們還檢測(cè)了糖尿病小鼠模型中HIF-1α的表達(dá)及PI3K/AKT信號(hào)通路的活化的改變。同時(shí)，為了進(jìn)一步證實(shí)藤黃酸對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變血管新生的抑制作用，我們也進(jìn)行了相應(yīng)的體外研究。將高糖條件下培養(yǎng)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞作為糖尿病

5、性視網(wǎng)膜病變的體外模型，然后檢測(cè)藤磺酸對(duì)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和形成管腔能力的影響。同時(shí)也對(duì)HIF-1α/VEGF信號(hào)及PI3K/AKT信號(hào)通路的活化進(jìn)行了研究。
　　方法:1、C57BL小鼠隨機(jī)分成5組，分別為對(duì)照組、糖尿病組、及糖尿病加不同劑量藤黃酸治療組;除對(duì)照組，其他組小鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型，然后治療組分別給予高、中、低劑量藤磺酸治療。2、HE染色檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜的組織形態(tài)學(xué)變化。3、CD31免疫熒光染色檢

6、測(cè)視網(wǎng)膜血管的新生。4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-A及VEGF-R2的表達(dá)水平的改變。5、Western blot檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-A、VEGF-R2、FGF2、HIF-1α、PI3K、AKT及p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平的變化。6、Real-time PCR檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF-A、VEGF-R2、FGF2和HIF-1α的表達(dá)水平的變化。7、高糖及高糖加藥物處理RF/6A細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)視

7、網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力的變化。8、劃痕愈傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的變化。9、小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管能力的變化。10、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中血管生成相關(guān)的VEGF-A和VEGF-R2的表達(dá)水平用Real-time PCR檢測(cè)。11、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF-A、VEGF-R2和HIF-1α的表達(dá)水平用Western blot檢測(cè)。12、免疫熒光檢測(cè)了視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的改變。13、W

8、estern blot檢測(cè)了藤黃酸對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變體外模型中PI3K/AKT信號(hào)通路活化的影響。
　　結(jié)果:1、藤黃酸能夠降低糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中血管新生相關(guān)因子VEGF-A及其受體VEGF-R2、FGF2的表達(dá)水平。2、糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α表達(dá)水平升高;而經(jīng)過藤黃酸治療后，糖尿病引起的HIF-1α表達(dá)上升被抑制。3、PI3K/AKT信號(hào)通路在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中過度激活;而藤黃酸治療能夠抑制糖尿病引起的PI3K/AKT

9、信號(hào)通路的過度活化。4、高糖條件下培養(yǎng)促進(jìn)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成;而藤黃酸處理后，高糖引起的細(xì)胞增殖、遷移和血管形成均被抑制。5、藤黃酸還能有效降低高糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF-A、VEGF-R2和HIF-1α的表達(dá)升高。6、藤黃酸可抑制高糖引起的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路的過度活化。
　　結(jié)論:1、藤黃酸對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變顯示出很好的治療效果。2、藤黃酸能夠降低糖尿病引起的視網(wǎng)膜中HIF