β-欖香烯對高氧誘導(dǎo)下新生小鼠視網(wǎng)膜新生血管凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 采用β-欖香烯(β-elemene)對視網(wǎng)膜新生血管病變進(jìn)行干預(yù)治療,觀察β-欖香烯對視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡的影響以及形態(tài)學(xué)特征,并探討β-欖香烯與新生小鼠視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系,為β-欖香烯治療新生血管疾病作基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究。
　　 方法：
　　 動(dòng)物模型的建立以及分組:36只7日齡清潔級C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組,陽性對照組,陰性對照組,實(shí)驗(yàn)組.。在高氧環(huán)境下(75±2%)

2、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組各12只鼠飼養(yǎng)5天,然后(12日齡)放入正常環(huán)境下飼養(yǎng)5天,誘導(dǎo)新生小鼠產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管的動(dòng)物模型。小鼠17日齡時(shí),實(shí)驗(yàn)組行玻璃體內(nèi)注射β-欖香烯,陽性對照組玻璃體內(nèi)注射空白乳劑。陰性對照組正常環(huán)境下飼養(yǎng)10天,17日齡玻璃體內(nèi)注射空白乳劑,不作其他任何處理。36只小鼠于21日齡全部深度麻醉致死,取小鼠右眼球常規(guī)石蠟包埋,進(jìn)行4um連續(xù)切片,HE染色觀察各組小鼠視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)以及計(jì)數(shù)突出于內(nèi)界膜之外的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核

3、,確定動(dòng)物模型的建模成功以及幫助排除Tunel染色的假陽性。
　　 Tunel法染色以及判定方法:采用Tunel法檢測陰性對照組,陽性對照組,以及實(shí)驗(yàn)組中視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況。Tunel試劑盒(1、標(biāo)記緩沖液(LabelingBuffer);2、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT);3、DIG-dUTP;4、封閉液(BlockingReagent);5、生物素化抗地高辛抗體(×100);6、SABC(×100);7、Pr

4、oteinaseK(×200);8、抗體稀釋液)購于武漢博士德公司。DAB顯色系統(tǒng)顯色試劑,購于武漢博士德公司。結(jié)果判定方法:新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡的陽性反應(yīng)為棕黃色顆粒定位于細(xì)胞核,有典型凋亡的形態(tài)特征:細(xì)胞體變小,染色體濃縮,核碎裂或者染色質(zhì)沿核膜呈半月形邊集或凋亡小體形成,即凋亡細(xì)胞。HE染色幫助排除假陽性,染色結(jié)果由倆位觀察者采用盲法每個(gè)切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(400×),計(jì)數(shù)200個(gè)突出于內(nèi)界膜之外新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核中陽性

5、細(xì)胞所占的百分比,即凋亡指數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)和樣本非配對t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有數(shù)據(jù)均采用SPSSforwindows17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)系統(tǒng)軟件處理。
　　 結(jié)果：
　　 一、HE染色結(jié)果
　　 1、陰性對照組小鼠視網(wǎng)膜表面光滑,內(nèi)核層和外核層細(xì)胞層次清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列整齊,為正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)組織。
　　 2、陽性對照組

6、小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)粗糙,視網(wǎng)膜增厚,大量新生血管形成,突出于內(nèi)界膜外的新生血管芽明顯可見,突出于內(nèi)界膜外的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核大量出現(xiàn),相比陰性對照組有較大差異。
　　 3、實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜表面相對比較光滑,結(jié)構(gòu)層次相對比較清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列相對整齊,偶有缺失。
　　 二、Tunel染色結(jié)果
　　 1、陰性對照組視網(wǎng)膜無明顯視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核突出于內(nèi)界膜之外,視網(wǎng)膜表面光滑,內(nèi)核層和外核層結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞排列完整

7、,也未見明顯的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡,為正常視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)組織。
　　 2、陽性對照組可見視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)粗糙,視網(wǎng)膜增厚,層次不清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列紊亂,大量突出于內(nèi)界膜之外的內(nèi)皮細(xì)胞核中偶有散在的凋亡細(xì)胞分布于內(nèi)界膜之外。
　　 3、實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜表面相對比較光滑,結(jié)構(gòu)層次相對比較清晰,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列相對整齊,有較多凋亡細(xì)胞分布內(nèi)界膜之外.
　　 4、陰性對照組凋亡指數(shù)為陰性,陽性對照組凋亡指數(shù)為1.21±0.50,實(shí)驗(yàn)組凋亡指

8、數(shù)8.50±1.76。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功建立高氧誘導(dǎo)下的新生小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型,β-欖香烯非常明顯地促進(jìn)了突出于內(nèi)界膜外的視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯凋亡。β-欖香烯干預(yù)后視網(wǎng)膜新生血管減少,視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變的比較完整,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列相對整齊,內(nèi)核層和外核層結(jié)構(gòu)清晰可見。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)通過對17日齡的C57/BL6J小鼠成功玻璃體內(nèi)注射p-欖香烯,4天后取材觀察(裂