兩種視網(wǎng)膜下新生血管小鼠模型基因表達譜的RNA-Seq研究.pdf

1、目的：Vldlr基因敲除小鼠和激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管的小鼠模型是研究年齡相關(guān)性黃斑變性的重要工具，但引起它們視網(wǎng)膜下新生血管（SNV）早期分子水平改變的機制尚未完全明確。本文基于RNA測序（RNA-Seq）技術(shù)，對這兩種SNV小鼠模型視網(wǎng)膜進行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學分析和驗證。
　　方法：分別取16天齡Vldlr-/-小鼠和野生型C57小鼠視網(wǎng)膜組織各3只，使用TRIzol和酚氯法提取視網(wǎng)膜總RNA。另外，使用Nd:YAG激光構(gòu)建

2、激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型后，用同樣的方法提取3只激光誘導(dǎo)CNV小鼠視網(wǎng)膜總RNA。在Illumina HiSeq2000平臺上對6個樣本所建的cDNA文庫按每個樣本200萬條100bp行末端配對法（pair-end）進行測序，所得讀數(shù)用Bowtie2.0.7版本比對到小鼠的全基因組序列（UCSC版本mm10）上，剪接接頭用TopHat2.0.8版本進行識別。RNA-Seq數(shù)據(jù)的定量和基因差異表達分析R語言包GenomeRanges、lib

3、Samtools和EdgeR完成。PANTHER、DAVID、Cytoscape、STRING、BINGO、GeneMania等生物信息學軟件以及EXCEL軟件綜合分析，系統(tǒng)評價了SNV差異表達基因的功能分類。利用qPCR對7個與SNV相關(guān)的基因進行mRNA表達水平的驗證。
　　結(jié)果：選取假發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05和編碼蛋白基因為過濾標準，與對照組相比，Vldlr-/-小鼠視網(wǎng)膜共檢測到1204個差異表達的基因中，763（63％）個

4、基因表達上調(diào)，而441（37%）個基因表達下調(diào)，生物信息學分析預(yù)測這些因子主要參與眼的發(fā)育、翻譯過程、黑色素合成和氧化磷酸化等生物學過程。激光誘導(dǎo)CNV小鼠視網(wǎng)膜共檢測到1399個差異表達的基因中，1092（78.1％）個基因表達上調(diào)，而307（21.9％）個基因表達下調(diào)，這些基因主要參與趨化因子或細胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、視覺感知等生物學過程。選擇符合FDR＜0.05，Log2FC≥2的基因作為進一步篩選標準，兩組數(shù)據(jù)中共存的

5、差異表達基因27個，運用生物信息學技術(shù)對分子功能（MF）、生物學過程（BP）和信號通路（pathway）進行分析顯示它們主要參與血管發(fā)育、新生血管形成、蛋白質(zhì)結(jié)合等生物學過程。qPCR結(jié)果顯示RNA倍數(shù)的變化與RNA-Seq結(jié)果相比，兩者變化方向一致。
　　結(jié)論：Vldlr基因敲除小鼠和激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管小鼠均是研究視網(wǎng)膜下新生血管形成良好動物模型，我們采用RNA-Seq技術(shù)對這兩種SNV小鼠模型視網(wǎng)膜進行測序，揭示了其視網(wǎng)膜