胃腫瘤特異性-相關性抗原(TSA-TAA)的篩選和治療性抗體的研發(fā).pdf

1、目的：制備胃癌特異性功能性單克隆抗體，鑒定其相應靶抗原蛋白，研究該單克隆抗體在體外和體內(nèi)的抑瘤功能，為胃癌的靶向治療提供候選抗體藥物。
　　方法：用源于4種胃癌細胞株（MKN45、SGC7901、NGC823及MKN28）的混合活性腫瘤細胞免疫BALB/C小鼠，并選擇高免疫反應的小鼠脾臟與小鼠的SP2/0細胞系融合而產(chǎn)生的抗體雜交瘤。繼而通過對雜交瘤抗體抗胃癌細胞系的高通量篩選、對正常人的外周血單核白細胞（PBMC）對照篩選、對胃

2、癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織對照篩選以及胃癌相關蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗技術（ELISA）檢測。綜合上述研究結(jié)果，選出命名為 MS57-2.1的胃癌特異性單克隆抗體進行后續(xù)研究。接著利用免疫熒光技術、免疫細胞化學技術鑒定 MS57-2.1單克隆抗體在胃癌細胞的定位。再通過免疫沉淀技術聯(lián)合高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜（LC-ESI MS/M S）分析技術（亦即：親和純化-質(zhì)譜分析技術）鑒定MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白質(zhì)。并以實

3、時定量PCR實驗技術（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡技術（Western blotting）鑒定MS57-2.1單克隆抗體靶抗原在8株胃癌細胞株和1株胃粘膜永生化上皮細胞株mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。在此基礎上，通過細胞增殖（CCK-8）實驗、Transwell腫瘤遷移和侵襲實驗研究MS57-2.1單克隆抗體在體外抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲等功能；并通過裸鼠腹腔種植胃癌細胞，以MS57-2.1單克隆抗體進行體內(nèi)治療性實驗。
　　

4、結(jié)果：雜交瘤聯(lián)合高通量流式細胞技術（HTS-FACS）篩選獲得5株抗胃癌特異性單克隆抗體，其中一株命名為MS57-2.1。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)MS57-2.1單克隆抗體可與特定胃癌細胞結(jié)合，而與正常人外周血細胞（PBMC）不結(jié)合。ELISA實驗結(jié)果表明 MS57-2.1單克隆抗體可與胃癌細胞膜蛋白結(jié)合，而與幽門螺旋桿菌蛋白和胃癌臨床常用分子標志物（CA15-3純化蛋白、CEA蛋白、PG-1/2蛋白）不結(jié)合或很少結(jié)合。細胞免疫熒光染色和免疫

5、細胞化學染色表明 MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原主要定位于胃癌細胞膜表面（有少部分靶抗原蛋白質(zhì)定位于胃癌細胞漿）。親和純化-質(zhì)譜分析技術鑒定獲得MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白為腸型堿性磷酸酶（ALPI）和胎盤樣堿性磷酸酶（ALPPL2）。qRT-PCR實驗結(jié)果表明ALPI和ALPPL2在8株胃癌細胞株和1株胃粘膜永生化上皮細胞株中在mRNA水平有不同程度的表達；Western blotting實驗結(jié)果表明ALPI和ALPPL

6、2在8株胃癌細胞株和1株胃粘膜永生化上皮細胞株中在蛋白質(zhì)水平有不同程度的表達。CCK-8實驗表明，以MS57-2.1單克隆抗體處理MKN45和BGC823胃癌細胞48小時后，較無關同型對照抗體處理組，胃癌細胞增殖受到明顯抑制，MS57-2.1單克隆抗體處理組48小時抑制率為20％，無關同型對照抗體處理組48小時抑制率為1%（p值＜0.05)；MS57-2.1單抗處理后胃癌細胞MKN45和BGC823移動能力受到明顯抑制，穿過小室細胞數(shù)（

7、37±2，59±2）顯著低于無關同型單抗對照組（177±4，147±4）和空白對照組（183±4，179±4），（P＜0.05）；在Transwell小室侵襲（已鋪膠）實驗中，MS57-2.1單抗處理后胃癌細胞MKN45和BGC823侵襲能力受到明顯抑制，穿膜的細胞數(shù)（11±2，12±2），顯著低于無關同型單抗對照組（189±4，151±4）和空白對照組（207±4，181±4）（P＜0.05）。在裸鼠腫瘤腹腔播散實驗中，MS57-2.

8、1單抗處理組的小鼠腫瘤播散程度（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)分別為1.5枚/只和1枚/只）顯著低于無關單抗處理組（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)目分別為8.5枚/只和7枚/只）和空白對照組（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)目9枚/只和6.5枚/只）（P＜0.05）。
　　結(jié)論：（1）MS57-2.1單克隆抗體具有胃癌特異性。（2）MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白是腸型堿性磷酸酶（ALPI）