肺炎克雷伯桿菌和嗜肺巴氏桿菌特異性抗原的篩選與鑒定.pdf

1、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia），嗜肺巴氏桿菌（Pasteurela pneumotropica）是實(shí)驗(yàn)動物特別是大小鼠的常見病原菌；實(shí)驗(yàn)動物感染后將對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。我國實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：無特定病原體（SPF）動物必須無此類細(xì)菌感染。當(dāng)今對于這兩種細(xì)菌的檢測主要是分離培養(yǎng)法，該方法因靈敏度低有待改進(jìn)?；谔禺愋钥乖难鍖W(xué)檢測方法擁有靈敏度高，特異性強(qiáng)，成本低，速度快，感染后恢復(fù)期的動物也能檢出等特點(diǎn)

2、，是實(shí)驗(yàn)動物病原感染檢測優(yōu)選方法。
　　 我們在對肺炎克雷伯桿菌特異性抗原的研究中，采用甲醛滅活的10種小鼠常見病原菌菌體免疫小鼠制備多克隆抗體，使用雙向電泳分離肺炎克雷伯桿菌的總蛋白，并以免疫印跡法（western blotting）與肺炎克雷伯桿菌多克隆抗體反應(yīng)，篩選出免疫原性強(qiáng)的蛋白抗原；再將細(xì)菌總蛋白與其他多克隆抗體反應(yīng)來排除交叉抗原。篩選出的特異性抗原蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過以上方法，發(fā)現(xiàn)在western blottin

3、g反應(yīng)中，有一個蛋白呈現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性和靈敏度，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為酸性磷酸酶（Acid phosphatase，Gi：238894261）蛋白。
　　 在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中查詢該蛋白的編碼序列，設(shè)計引物擴(kuò)增該基因，構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)純化后，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對靈敏度和特異性進(jìn)行驗(yàn)證，以陽性反應(yīng)吸光度的平均值（A值）與交叉反應(yīng)的A值之比確定信噪比。結(jié)果顯示，該蛋白信噪比可達(dá)3.25，證明酸性磷

4、酸酶為肺炎克雷伯桿菌的特異性抗原蛋白。
　　 嗜肺巴氏桿菌由于不能查到其基因組信息，嘗試從其親緣關(guān)系最近的菌種多殺巴氏桿菌中篩選特異性抗原。使用多殺巴氏桿菌總蛋白與嗜肺巴氏桿菌多抗反應(yīng)篩選高靈敏度抗原，而與其他細(xì)菌多抗反應(yīng)排除交叉抗原。結(jié)果顯示，hypothetical proteinPM1693（Gi：15603558）呈現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性和靈敏度，信噪比2.36，又由于小鼠不易感染多殺巴氏桿菌，該蛋白有望作為小鼠嗜肺巴氏桿菌檢