肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌代謝調(diào)控及轉(zhuǎn)錄傳感元件的研究.pdf

1、3-羥基丙酸（3-HP）為非手性有機酸，化學(xué)性質(zhì)活躍，可轉(zhuǎn)化為一系列重要化合物，且具有化學(xué)變通性。目前，商業(yè)化生產(chǎn)3-HP多為化學(xué)合成法，成本高、轉(zhuǎn)化率低、分離純化難度大，使得其生產(chǎn)方法亟待完善。微生物法產(chǎn)3-HP具有成本低和污染少等優(yōu)勢。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，微生物生產(chǎn)3-HP引起人們關(guān)注。然而，微生物產(chǎn)3-HP的模式化生產(chǎn)仍然存在挑戰(zhàn)。3-HP的研究需從多方面提高其產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，比如代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。為此，本實驗對肺炎克雷伯

2、氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)與大腸桿菌(Escherichia coli)的代謝調(diào)控及轉(zhuǎn)錄傳感元件進行了研究。本實驗設(shè)計與工作包括以下三方向內(nèi)容:
　　1.K.pneumoniae中轉(zhuǎn)錄傳感元件與pk啟動子相互作用的研究?？疾炝薘NA聚合酶的σ因子與甘油脫水酶pk啟動子的親和性，旨在增強3-HP合成基因的轉(zhuǎn)錄表達，提高3-HP的產(chǎn)量。實驗篩選了3個sigma因子rpoE、rpoS、dksA并對其進行超表達。引

3、入卡那霉素抗性基因的啟動子Pkana以排除甘油脫水酶自身的pk啟動子對此3個因子超表達的干擾，采用綠色熒光蛋白基因（gfp）以驗證表達量的強弱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rpoE的表達增強了pk啟動子的效率。于是將醛脫氫酶的基因ald4替換gfp，得到重組菌K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)。酶活和SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，ald4的酶活所提高，SDS-PAGE中顯示ald4的表達條帶。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，重組工程菌

4、K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP產(chǎn)量是對照組K.pneumoniae(pET-pk-ald4)的1.6倍。上罐發(fā)酵
　　TQ921.7
　　Q819
　　結(jié)果表明，重組菌K.pneumoniae(pET-pk-ald4-pkana-rpoE)的3-HP和1，3-丙二醇(1，3-PD)的轉(zhuǎn)化率分別為0.105 mol/mol和0.34 mol/mol，總轉(zhuǎn)化率為0.445

5、 mol/mol。3-HP和1，3-PD的產(chǎn)量得以顯著提高。因此，rpoE和pk啟動子的適配性更高，提高了pk啟動子的轉(zhuǎn)錄效率，促進了后續(xù)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。
　　2.E.coli和K.pneumoniae的共培養(yǎng)研究。構(gòu)建出攜帶不同抗性的K.pneumoniae與E.coii，以辨別并探究兩菌的混菌體系。因此，克隆了E.coli中的cm基因，構(gòu)建了重組工程菌E.coli(pET-cm)和K.pneumoniae(pET-28a)。E

6、.coli(pET-cm)攜帶氯霉素和卡那霉素雙重抗性，而K.pneumoniae(pET-28a)只攜帶卡那霉素抗性?？疾炝薑.pneumoniae與E.coli單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)的相對菌落數(shù)及存活率，結(jié)果顯示，共培養(yǎng)中E.coli受到的生長抑制比K.pneumoniae更大，K.pneumoniae為共培養(yǎng)中的優(yōu)勢菌種。
　　3.針對K.pneumoniae中3-HP代謝分向的研究。弱化K.pneumoniae中產(chǎn)3-HP的副產(chǎn)

7、物途徑，降低或消除其中一些副產(chǎn)物對3-HP的影響。本實驗設(shè)計以提高3-HP的產(chǎn)量為前提，探究3-HP代謝流之間的相互關(guān)系。實驗涉及K.pneumoniae甘油途徑中的八個相關(guān)酶基因:pmd(KPN01632)、poxB(KPN00904)、frdB(KPN04552)、fumC(KPN01517)、dhaT(KPN03491)、ilvH(KPN00083)、adhP(KPN01853)和pflB(KPN00931)。分別敲除了以上8個酶

8、基因，弱化了八條代謝分支途徑，構(gòu)建了八株單基因敲除工程菌。對8株單基因敲除工程菌途徑代謝物進行檢測，分析單基因敲除工程菌中代謝流的變化，篩選出高產(chǎn)3-HP的工程菌。此外，對篩選出的最合適的兩種酶基因進行組合敲除，測定組合敲除菌途徑中代謝物的變化。在組合敲除菌中導(dǎo)入高產(chǎn)3-HP重組質(zhì)粒tac-puuC，分析代謝物產(chǎn)量。由8株單基因敲除工程菌的搖瓶發(fā)酵結(jié)果可知，K.pneumoniae（△adhP）、K.pneumoniae(△pflB)的

9、3-HP和1，3-PD相對產(chǎn)量較高，更適合做多基因敲除的表達宿主。由組合敲除菌的搖瓶和上罐發(fā)酵結(jié)果可知， K.pneumoniae△adhP△pflB(tac-puuC)在60 h時3-HP的產(chǎn)量達到了66.91 g/L，1，3-丙二醇的產(chǎn)量達到了3.85 g/L。此外，該重組菌K.pneumoniae△adhP△pflB(tac-puuC)的乳酸產(chǎn)量最高只為19.40 g/L，副產(chǎn)物的產(chǎn)量降低至對照組的1/3。該菌是生產(chǎn)3-HP的理想