克雷伯肺炎桿菌合成乙偶姻的代謝機(jī)理研究.pdf

1、Klebsiella pneumoniae（kp）是一種優(yōu)良的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株，R-乙偶姻是2，3-丁二醇合成途徑中的一個(gè)中間代謝產(chǎn)物，野生菌株中R-乙偶姻積累量很少，而缺失了丁二醇還原酶活性的kp-△budC具有很高的R-乙偶姻積累能力。本文構(gòu)建了一系列與R-乙偶姻合成和分解代謝相關(guān)基因的突變株，通過這些突變株代謝特性變化，對Klebsiella pneumoniae合成R-乙偶姻的機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　kp-△budC以

2、葡萄糖為碳源合成R-乙偶姻的過程中，當(dāng)葡萄糖耗盡后，發(fā)酵液中積累的R-乙偶姻會被細(xì)胞當(dāng)做碳源再次利用。乙偶姻的再次利用是由乙偶姻脫氫酶復(fù)合物催化分解形成乙酰CoA和乙醛。aco基因缺失的突變株kp-△budC-△aco不能以乙偶姻為唯一碳源進(jìn)行生長代謝，積累的乙偶姻也不會被分解代謝。然而，當(dāng)存在其他碳源時(shí)，積累的乙偶姻可以轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇。這是由于除了丁二醇脫氫酶，細(xì)胞內(nèi)還存在其他轉(zhuǎn)化乙偶姻還原成2，3-丁二醇的酶。利用kp-△bu

3、dC突變株批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，好氧發(fā)酵以及弱酸性環(huán)境有利于R-乙偶姻的積累。利用kp-△budC-△aco雙敲突變株在優(yōu)化的發(fā)酵條件下進(jìn)行57h補(bǔ)料分批發(fā)酵，得到了62.3g/L的R-乙偶姻，光學(xué)純度達(dá)到98％，底物轉(zhuǎn)化率為28.7％。
　　已經(jīng)報(bào)道的能夠催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成2，3-丁二醇的酶包括:甘油脫氫酶dhaD、甘油脫氫酶gldA，和短鏈酰基脫氫酶acyl。在kp-△budC的基礎(chǔ)上，本文構(gòu)建了kp-△budC-△

4、dhaD-△gldA-△acyl四基因缺失突變株，經(jīng)過補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)后，突變株的2，3-丁二醇產(chǎn)量相較于對照kp-△budC有所下降，但仍然有2，3-丁二醇合成，R-乙偶姻產(chǎn)量也沒有明顯增加。
　　乳酸和乙醇是乙偶姻發(fā)酵過程中的兩個(gè)主要副產(chǎn)物。為了降低這些副產(chǎn)物產(chǎn)量，提高乙偶姻合成途徑代謝流，本文構(gòu)建了kp-△budC-△ldh、kp-△budC-△adhE、kp-△budC-△ldh-△adhE三株突變株。突變株發(fā)酵結(jié)果顯示相

5、較于對照kp-△budC，R-乙偶姻產(chǎn)量并沒有明顯增加，但2，3-丁二醇產(chǎn)量有所上升。
　　為了更進(jìn)一步探尋R-乙偶姻與2，3-丁二醇的代謝途徑，分別構(gòu)建了缺失α-乙酰乳酸合成酶基因budB、ilvB、ilvI的突變株，發(fā)酵結(jié)果顯示kp-△budB無乙偶姻與2，3-丁二醇的積累，證明了乙酰乳酸合成酶途徑是乙偶姻與2，3-丁二醇的唯一代謝途徑，在此途徑之后除了budC、dhaD、gldA、acyl途徑之外還有別的2，3-丁二醇生成途

6、徑。而kp-△ilvB與kp-△ilvI發(fā)酵結(jié)果顯示這兩個(gè)基因?qū)τ谝遗家龊?，3-丁二醇合成無明顯影響。
　　乙偶姻脫氫酶復(fù)合物除了催化乙偶姻分解外，還催化丙酮酸代謝成乙酰CoA，細(xì)胞內(nèi)還存在另外一個(gè)催化丙酮酸到乙酰CoA的酶-丙酮酸甲酸裂解酶。兩者催化的反應(yīng)差別在于，乙偶姻脫氫酶復(fù)合物催化的反應(yīng)產(chǎn)生一分子NADH，而丙酮酸甲酸裂解酶催化的反應(yīng)不產(chǎn)生NADH。kp-△aco和kp-△pflB是兩個(gè)酶分別失活的突變株。kp-△pfl

7、B和kp-△budC-△pflB合成大量乳酸，進(jìn)而構(gòu)建了kp-△pflB-△ldh和kp-△budC-△pflB-△ldh菌株消除乳酸合成。kp-△budC-△aco、kp-△budC-△pflB、kp-△budC-△pflB-△ldh以葡萄糖為碳源批次發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，結(jié)果顯示乙偶姻產(chǎn)量相較于對照kp-△budC并沒有明顯增加。然而kp-△aco分別以甘油和葡萄糖為碳源合成1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的生產(chǎn)速率明顯增加。kp-△pfl