克雷伯肺炎桿菌中2,3-丁二醇手性異構體合成途徑的解析和調(diào)控研究.pdf

1、Klebsiella pneumoniae是最具工業(yè)化應用前景的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株之一，文獻報道其合成的是內(nèi)消旋2，3-丁二醇和2S，3S丁二醇兩種立體異構體的混合物，但是本研究發(fā)現(xiàn)其合成的2，3-丁二醇是三種立體異構體的混合物。針對這一現(xiàn)象，本研究通過構建2，3-丁二醇合成途徑相關基因缺失的突變株并對突變株代謝特性進行研究，結(jié)合相關酶蛋白體外催化特性，解析了K.pneumoniae2，3-丁二醇三種立體異構體的合成途徑。構建的突變

2、株中，K.pneumoniae△budC具有較高的R-乙偶姻合成能力，對其用于R-乙偶姻生產(chǎn)進行了進一步的研究。在突變株的構建過程中，對菌株基因同源重組方法進行了研究，開發(fā)了一種通過敲除菌株recB基因來提高重組效率的方法。
　　K.pneumoniae利用葡萄糖和甘油為碳源合成的2，3-丁二醇中三種立體異構體的比例不同，利用甘油為碳源合成的2R，3R-丁二醇比例明顯提高，推測甘油代謝相關酶可能參與2R，3R-丁二醇合成。dhaD

3、編碼甘油脫氫酶，該基因突變菌株K.pneumoniae△dhaD失去了合成2R，3R-丁二醇的能力，其他代謝產(chǎn)物無顯著變化，表明2R，3R-丁二醇合成依賴于該基因的活性。budA編碼α-乙酰乳酸脫羧酶，該突變株的內(nèi)消旋2，3-丁二醇和2R，3R-丁二醇合成能力顯著降低，而2S，3S-丁二醇合成不受影響。budC編碼丁二醇脫氫酶，該基因的突變株K.pneumoniae△budC內(nèi)消旋2，3-丁二醇合成能力顯著降低，而2R，3R-丁二醇合成

4、顯著提高。該菌利用葡萄糖為碳源時在發(fā)酵液中大量積累的R-乙偶姻，利用甘油為碳源時合成高水平2R，3R-丁二醇。
　　將dhaD和budC分別克隆連接到表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中進行高水平表達，并利用組氨酸標簽對酶蛋白進行分離純化。純化后的酶蛋白進行體外酶促反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘油脫氫酶在酮基和羥基的氧化還原反應中對R構型羥基具有特異選擇性，催化R-乙偶姻轉(zhuǎn)化為2R，3R-丁二醇，催化S-乙偶姻轉(zhuǎn)化為meso-2，3-丁二醇;丁二醇脫氫酶有S

5、-立體對映選擇性，催化R-乙偶姻轉(zhuǎn)化成meso-2，3-丁二醇，催化雙乙酰到S-乙偶姻，進一步合成2S，3S-丁二醇。
　　根據(jù)突變株代謝特征結(jié)合酶促反應結(jié)果，解析出2，3-丁二醇立體異構體合成途徑機制為:菌株經(jīng)乙酰乳酸脫羧酶形成R-乙偶姻，R-乙偶姻經(jīng)過丁二醇脫氫酶催化還原形成內(nèi)消旋2，3-丁二醇。同時R-乙偶姻在甘油脫氫酶的催化下形成2R，3R-丁二醇。乙酰乳酸自發(fā)裂解形成的雙乙酰在丁二醇還原酶的催化下形成S-乙偶姻，S-乙偶

6、姻經(jīng)過丁二醇脫氫酶還原成2S，3S丁二醇。同時S-乙偶姻也可由甘油脫氫酶還原形成meso-2，3-丁二醇。
　　K.pneumoniae△budC合成R-乙偶姻的研究發(fā)現(xiàn)，菌株具有很高的R-乙偶姻積累能力，48 h發(fā)酵水平達到58.99 g/L。進一步對菌株中能消耗R-乙偶姻的甘油脫氫酶基因dhaD和乙偶姻脫氫酶復合物基因aco進行了敲除工作，構建了雙基因缺失突變株和三基因缺失突變株。但是發(fā)酵結(jié)果顯示這些突變株乙偶姻產(chǎn)量沒有明顯增

7、加。
　　突變株構建過程使用Red重組酶輔助的同源重組方法。在K.pneumoniae中重組效率較大腸桿菌中低，同時抗性合中所需要的同源臂較長。分析原因可能是Gam亞基對宿主細胞的RecBCD的核酸外切酶活性抑制較弱。構建缺失gam基因的重組酶質(zhì)粒和recB基因缺失突變株。缺失gam基因的Red重組酶重組效率較完整Red重組酶有顯著降低，表明Gam亞基對K.pneumoniae的RecBCD的核酸外切酶活性具有抑制作用。Red重組