過(guò)表達(dá)乳糖代謝途徑關(guān)鍵酶對(duì)產(chǎn)2,3-丁二醇菌株利用乳糖效率的影響.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：Q815密級(jí)：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號(hào)：11809001過(guò)表達(dá)乳糖代謝途徑關(guān)鍵酶對(duì)產(chǎn)2，3一丁二醇菌株利用乳糖效率的影響EffectsofOVerexpressionofKeyEnzymesofLactoseMetabolicPathwayonUtilizationEfficiencyfromLactosein23ButanediolProductionStrain專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師姓名：肖冬光

2、教授研究生姓名：曹春紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：工學(xué)碩士論文提交日期：2014年3月論文課題來(lái)源：教師自選學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要2，3一丁二醇作為一種重要的生物化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于化工、燃料、食品、航空航天等領(lǐng)域。乳清是乳制品行業(yè)的主要副產(chǎn)物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)化工產(chǎn)品方面主要用于生產(chǎn)燃料乙醇。與生產(chǎn)燃料乙醇相比，2。3一丁二醇具有更高的產(chǎn)品附加值。陰溝腸桿菌CICC10011是目前用于生產(chǎn)2，3一丁二醇研究最多的菌株，其2，3丁二醇

3、的得率及最終產(chǎn)物濃度均很高，但利用乳糖發(fā)酵較慢；而肺炎克雷伯氏菌KGl雖然在23丁二醇生成能力方面略次于10011，但其利用乳糖速度較快。本實(shí)驗(yàn)以KGl和10011為出發(fā)菌株，通過(guò)過(guò)表達(dá)乳糖代謝途徑關(guān)鍵酶(乳糖通透酶和B一半乳糖苷酶)，以期望提高菌株對(duì)乳糖的利用效率。主要內(nèi)容和結(jié)果如下：(1)在KGl和10011菌株乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加B半乳糖苷酶，比較不同添加量的p半乳糖苷酶對(duì)菌株利用乳糖速度的影響。結(jié)果表明外源添加p半乳糖苷酶可以加

4、快KGl和1001llJ用乳糖的速度。(2)以KGl基因組為模板擴(kuò)增p半乳糖苷酶基因啦B和乳糖通透酶基[]lacY(記做脅c】，)，以EcoliMGl655基因組為模板擴(kuò)增乳糖通透酶基因lacY(記做E砌c】，)，將三個(gè)基因片段單獨(dú)連接到表達(dá)載體pUCl8K上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)入KGl和10011中，得到重組菌株KGl／pUCl8KbgaB，KGl／pUCl8K—ElacY，KGl／pUCl8KK1acY和10011／pUCl

5、8K—bgaB，10011／pUCl8KElacY，10011／pUCl8K—KlacY。(3)對(duì)KGl／pUCl8KbgaB，10011／pUCl8K—bgaB進(jìn)行SDSPAGE分析和D一半乳糖苷酶活性的測(cè)定，KGl／pUCl8K—bgaB的B一半乳糖苷酶活力是KGl的3308倍；10011／pUCl8K—bgaB的B一半乳糖苷酶活力是10011的345倍。乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，10011／pUCl8KbgaB菌株發(fā)酵時(shí)間縮短了12h，最大

6、乳糖比消耗速率提高了3870％，發(fā)酵終點(diǎn)2，3丁二醇產(chǎn)量略高于原菌。KGl／pUCl8K—bgaB菌株乳糖消耗速度變慢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，KGl／pUCl8KbgaB的殘?zhí)菫?103g／L。(4)乳糖通透酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示，KGl／pUCl8KElacY酶活力是KGl的201倍，10011／pUCl8KElacY酶活力是10011的175倍。乳糖發(fā)酵結(jié)果顯示，KGl／pUCl8K—E1acY，10011／pUCl8K—ElacY幣1：1對(duì)應(yīng)

7、原菌相比，發(fā)酵速度分別提高了25O％和125％，最大乳糖比消耗速率分別提高了662％$f1467％。說(shuō)明Elacy基因的過(guò)量表達(dá)提高了兩株基因工程菌對(duì)乳糖的利用速度，同時(shí)不影響2，3一丁二醇的生成量。(5)乳糖通透酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示，KGI／pUCl8KKlacY酶活力是KGl的192倍；10011／pUCl8KKlacY酶活力是10011的173倍。KGI／pUCl8KKlacY，10011／pUCl8K一ⅪacY對(duì)乳糖的利用速度沒(méi)