靶向細(xì)胞周期蛋白D1核酶和晚期糖基化終產(chǎn)物受體siRNA抑制大鼠肝纖維化研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：靶向細(xì)胞周期蛋白D1核酶對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的：鑒定特異性核酶(ribzme,Rz)在體外和細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)mRNA的切割活性；研究特異性核酶抑制cyclin D1基因表達(dá)對(duì)活化型大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)生物學(xué)特性的影響。 方法：應(yīng)用mfold軟件設(shè)計(jì)、合成針對(duì)大鼠cyclin D1 mRN

2、A不同切割位點(diǎn)的Rz基因,構(gòu)建核酶基因和靶基因體外轉(zhuǎn)錄載體,體外轉(zhuǎn)錄Rz基因和靶基因并進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn),放射自顯影鑒定核酶的胞外活性；構(gòu)建特異性Rz真核表達(dá)載體pLXSN-Rz,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞,用G418篩選出陽性細(xì)胞克隆；分別應(yīng)用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)cyclin D1、α-SMA、I型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)基因的表達(dá),鑒定核酶的胞內(nèi)活性并評(píng)價(jià)核酶對(duì)活化型HSCs生物

3、學(xué)特性的影響。 結(jié)論：Rz832在體外對(duì)靶基因有良好的切割活性；pLXSN-Rz832表達(dá)的特異性Rz在HSC-T6細(xì)胞內(nèi)也能有效地切割靶基因,明顯抑HSCs的激活。因此,cyclin D1有望成為一個(gè)潛在的抗HF基因治療的新靶點(diǎn),cyclin D1特異性核酶有可能成為抑HSCs激活的有效核酸藥物。 第二部分：靶向晚期糖基化終產(chǎn)物受體siRNA抑制肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化(hepa

4、tic fibrosis,HF)形成過程中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化及其與HF程度的關(guān)系；研究特異性siRNA對(duì)大鼠HSC-T6細(xì)胞RAGE基因表達(dá)及其生物學(xué)特性的影響：探討RAGE特異性siRNA對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF的抑制作用及機(jī)制。 方法： 1、以50％CCl4腹腔注射制備大鼠HF模型,應(yīng)用實(shí)時(shí)定

5、量PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HF不同階段肝組織RAGE、NF-κB、α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)水平的變化；應(yīng)用HE及天狼猩紅(Sirius red)染色對(duì)HF大鼠肝臟行組織學(xué)檢查,以Scheuer改良評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝臟進(jìn)行炎癥活動(dòng)度分級(jí)和纖維化程度分期；分別應(yīng)用酶試劑法和放射免疫法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽紅素(to

6、tal bilirubin,TBIL)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、Ⅲ型前膠原(precollagen type Ⅲ,PCⅢ)和層粘連蛋白(laminin,LN)水平。 2、應(yīng)用RNA設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)針對(duì)RAGE mRNA 417-437、221-241和534-554位點(diǎn)的三對(duì)21核苷酸(nt)siRNA,合成能編碼相應(yīng)特異性siRNA的寡核苷酸雙鏈R1、R2和R3;構(gòu)建RAGE特異性siRNA表達(dá)載pGC

7、si-R1、pGCsi-R2和pGCsi-R3,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting檢測(cè)特異性siRNA對(duì)HSC-T6細(xì)胞RAGE表達(dá)的沉默效率。 3、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting分析特異性siRNA抑制RAGE對(duì)HSC-T6細(xì)胞α-SMA、NF-κB表達(dá)、合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等生物學(xué)特性的影響。 4、

8、經(jīng)脂質(zhì)體尾靜脈注射法將pGCsi-R1轉(zhuǎn)染HF大鼠肝臟,6周后應(yīng)用R1編碼的RAGE siRNA正義鏈序列特異性探針通過Northern blot分析檢測(cè)各組大鼠肝臟中RAGE siRNA的表達(dá),應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting和免疫組化分析特異性siRNA對(duì)肝組織RAGE表達(dá)的抑制效率,應(yīng)用HE染色、Sirius red染色對(duì)大鼠肝臟行組織學(xué)檢查,以Scheuer改良評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行炎癥活動(dòng)度分級(jí)和纖維化程度分期,應(yīng)用

9、酶試劑法、放射免疫法、實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting、凝膠電泳遷移分析及免疫組織化學(xué)染色分析特異性siRNA抑制RAGE對(duì)HF大鼠血清學(xué)、肝功能、HSCs活化、肝組織ECM的合成和分泌、NF-κB基因的表達(dá)和活性及IκBα濠達(dá)的影響,應(yīng)用透射電鏡觀察特異性siRNA抑制RAGE對(duì)HF大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)論： 1、RAGE在CCl4誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠HF中的表達(dá)水平明顯上調(diào),且與HF程度、血清纖維

10、化指標(biāo)、ALT和TBIL水平及NF-κB、α-SMA、I型膠原的表達(dá)水平變化呈正相關(guān),而與血清ALB水平呈負(fù)相關(guān)； 2、成功構(gòu)建RAGE特異性siRNA表達(dá)載體,pGCsi-R1表達(dá)的特異性siRNA能有效抑制HSC-T6細(xì)胞中RAGE基因的表達(dá),其最大抑制效率為(79.65±8.88)％,有效抑制時(shí)間超過72 h； 3、RAGE特異性siRNA能明顯抑制HSCs的激活、NF-κB的表達(dá)和ECM的合成及分泌； 4