PARP抑制劑3-AB對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的帕金森病大鼠血腦屏障通透性及多巴胺能神經(jīng)元的作用及機(jī)制.pdf

1、前言
　　帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種中老年常見的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，以黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性缺失為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD的病因及機(jī)制尚不清楚，但近期大量研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)激發(fā)或加重DA能神經(jīng)元變性起著非常重要的作用。黑質(zhì)紋狀體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活并釋放大量前炎性因子，并破壞血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能。已經(jīng)證實(shí)血腦屏障的破壞促進(jìn)PD的進(jìn)展。多種不同的PD模型均能發(fā)現(xiàn)

2、血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞，而保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性可以緩解PD的進(jìn)展。在PD中血腦屏障功能受損，加重神經(jīng)元損傷及死亡，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。近期一些研究發(fā)現(xiàn)多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PAPP]在其中發(fā)揮重要作用。PARP是一種富含核染色質(zhì)的多功能核酶，在腦外傷和缺血再灌注時(shí)激活，PARP對(duì)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞發(fā)揮重要作用。
　　目前PARP是否對(duì)神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的血腦屏障

3、結(jié)構(gòu)和功能的破壞發(fā)揮作用尚無報(bào)道。我們應(yīng)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介導(dǎo)的PD模型，驗(yàn)證PARP抑制劑3-氨基苯甲酰(3-aminobenzamide，3-AB)能否緩解血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的破壞，并保護(hù)黑質(zhì)紋狀體內(nèi)DA神經(jīng)元，為PD的防治提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
　　實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成三組:對(duì)照組（注射等量滅菌生理鹽水大鼠）(n=40)，LPS組(n=60)和LPS

4、+3-AB組(n=55)。進(jìn)一步根據(jù)注射LPS時(shí)間不同，將LPS組又分為0h組(n=5)，6h組(n=5)，12h組(n=20)，18h組(n=5)，24h組(n=5)，72h組(n=5)，7d組(n=15)。其中，12h組5只用于血腦屏障通透性的測(cè)定，5只用于免疫組化分析，5只用于ELISA檢測(cè);5只用于Westernblot檢測(cè)，;7d組5只用于血腦屏障通透性的測(cè)定，5只用于免疫組化分析，5只用于ELISA檢測(cè)。Westernblo

5、t檢測(cè)LPS+3-AB組根據(jù)3-AB不同濃度分為:0mg/kg組(n=5)，5mg/kg組(n=5)，10mg/kg組(n=35)，20mg/kg組(n=5)，40mg/kg組(n=5)。
　　2、大鼠模型的制備
　　(1)LPS誘導(dǎo)的PD模型（LPS組）:以10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠頭部俯臥位固定于立體定位儀上，剪毛，常規(guī)消毒皮膚，正中切口，切開頭皮、皮下組織和骨膜，根據(jù)文獻(xiàn)[19]，選擇黑

6、質(zhì)致密部(SNPc)，坐標(biāo):前囪后5.5mm，中縫旁開1.8mm，硬膜下8.3mm。按上述坐標(biāo)用牙科鉆鉆開顱骨后，用微量注射器注入2μlLPS溶液(濃度5μg/2μl)，給藥速度為1μl/min，給藥完畢留針10分鐘后緩慢退針，以防藥液溢出。消毒后縫合皮膚。
　　(2)對(duì)照組:向中腦注入與LPS等量的滅菌生理鹽水，其他條件同模型組。
　　(3)LPS+3-AB組:在黑質(zhì)內(nèi)注射LPS前10分鐘經(jīng)左側(cè)股靜脈注入3-AB，其他條件

7、同模型組。
　　3、Evansblue滲透法評(píng)估黑質(zhì)血腦屏障通透性的變化
　　4、免疫組化法檢測(cè)黑質(zhì)緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5，occludin，和ZO-1的表達(dá)變化
　　5、免疫組化法檢測(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)的變化
　　6、ELISA法檢測(cè)黑質(zhì)IL-1β和TNF-α的含量變化
　　7、免疫熒光法檢測(cè)黑質(zhì)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)的變化
　　8、Westernblot法檢測(cè)黑質(zhì)ERK1/2，p38MA

8、PK表達(dá)的變化
　　結(jié)果
　　1、血腦屏障通透性的變化
　　與對(duì)照組相比，LPS組注射LPS同側(cè)黑質(zhì)明顯藍(lán)染，黑質(zhì)內(nèi)EB的含量顯著升高，在注射12h后達(dá)到最高值，然后逐漸下降。LPS+3-AB組黑質(zhì)EB含量隨3-AB濃度的升高而顯著降低，10mg/kg組，20mg/kg組和40mg/kg組的EB含量較5mg/kg組顯著降低(P＜0.05)，三組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5，oc

9、cludin，和ZO-1的表達(dá)變化
　　應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)各組黑質(zhì)claudin-5，occludin和ZO-1的表達(dá)情況。claudin-5，occludin和ZO-1蛋白在各組大鼠腦組織中均沿血管呈陽性表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組分別顯著降低claudin-5，occludin和ZO-1的表達(dá)水平(P＜0.05,P＜0.05，P＜0.05)。與LPS組相比，LPS+3-AB組claudin-5，occludi

10、n和ZO-1的表達(dá)分別顯著增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。
　　3、黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)的變化
　　與對(duì)照組相比，LPS組顯著降低大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)(P＜0.05);與LPS組相比，LPS+3-AB組的TH陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05)。
　　4、黑質(zhì)IL-1β和TNF-α的含量變化
　　ELISA法檢測(cè)黑質(zhì)IL-1β和TNF-α的含量結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS注射12h和7d的IL

11、-1β和TNF-α含量均顯著增高(P＜0.05)，與LPS組相比，LPS+3-AB組的12h和7d的IL-1β和TNF-α含量均顯著降低(P＜0.05)。
　　5、黑質(zhì)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)的變化
　　免疫熒光染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠黑質(zhì)OX-42陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，呈現(xiàn)出分枝狀靜息狀態(tài)，胞體較小，具有細(xì)而長(zhǎng)的細(xì)胞突起，免疫著色較淺。LPS組OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，呈現(xiàn)出胞體增大，突觸短而粗的激活狀態(tài)。與LPS

12、組比較，LPS+3-AB組OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量明顯下降，大多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)出靜息狀態(tài)。
　　6、黑質(zhì)ERK1/2、p38MAPK表達(dá)的變化
　　應(yīng)用westernbloting方法檢測(cè)黑質(zhì)中ERK1/2，p-ERK1/2，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LPS組的p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38MAPK/p38MAPK均顯著增加(P＜0.01)。與LPS組相比，LPS+3-AB

13、組的p-ERK1/2/ERK1/2顯著下降(P＜0.01)，而p-p38MAPK/p38MAPK顯著增加(P＜0.01)。
　　討論
　　本研究通過建立黑質(zhì)內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)的PD模型，并給予3-AB，觀察3-AB對(duì)PD血腦屏障和DA能神經(jīng)元的影響，通過測(cè)定黑質(zhì)EB含量評(píng)估BBB通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠黑質(zhì)內(nèi)注射LPS后，BBB通透性顯著升高，在12h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。免疫組化結(jié)果顯示LPS注射12h后，BBB緊密連接

14、蛋白claudin-5，occludin和ZO-1的表達(dá)顯著降低，DA能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。以上結(jié)果提示LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥顯著破壞了BBB的完整性，降低緊密連接蛋白的水平，增加了BBB的通透性。
　　PARP是一種多功能酶，具有蛋白修飾和核苷酸聚合作用，參與DNA的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，修復(fù)，基因調(diào)控，信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞死亡等過程。研究證實(shí)，PARP與炎癥，自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)3-AB可顯著抑制L

15、PS誘導(dǎo)的BBB通透性的增加，并且與濃度相關(guān)。3-AB10mg/kg組，20mg/kg組和40mg/kg組的EB含量較5mg/kg組顯著降低，三組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)3-AB能緩解LPS組緊密連接蛋白claudin-5，occludin和ZO-1的降低，與LPS組比較有顯著差異。以上結(jié)果說明PARP抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的PD模型的BBB有保護(hù)作用。這與其他實(shí)驗(yàn)中PARP抑制劑有BBB保護(hù)作用的結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)給予3-AB

16、明顯提高黑質(zhì)內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)，與LPS組比較有顯著差異，對(duì)PD大鼠起保護(hù)作用。在炎癥等病理情況下，PARP被過度活化，激活相關(guān)細(xì)胞死亡蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞死亡。與我們的研究結(jié)果相似的是，Outeiro等發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑能夠保護(hù)MPP(+)介導(dǎo)的DA能神經(jīng)元。Yokoyama等證實(shí)PARP抑制劑可緩解MPTP介導(dǎo)的神經(jīng)毒性，阻止神經(jīng)元的損傷。而且大量研究還發(fā)現(xiàn)抑制PARP可緩解不同臟器的炎癥反應(yīng)。
　　本研究建立黑質(zhì)注射LPS誘導(dǎo)的PD

17、模型，應(yīng)用免疫熒光組化法檢測(cè)OX-42表達(dá)情況，結(jié)果顯示，對(duì)照組黑質(zhì)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量較少，且大多數(shù)呈靜息狀態(tài);而注射LPS7天后大量小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，細(xì)胞突起變短，變成圓形、阿米巴狀或桿狀。給予3-AB后黑質(zhì)內(nèi)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)較LPS組顯著減少，而且大多數(shù)細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，說明3-AB顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　應(yīng)用ELISA法檢測(cè)黑質(zhì)內(nèi)前炎性因子IL-1β和TNF-α的水平，結(jié)果顯示LPS注射后，腦組織

18、中IL-1β和TNF-α的含量顯著升高，給予3-AB后，二者分別下降45％，55％。與我們的結(jié)果相似的是，Balazs等發(fā)現(xiàn)另一種PARP-1抑制劑4-HQN可以抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克所致的TNF-α的升高，這說明PARP抑制劑有助于緩解炎癥反應(yīng)。我們從試驗(yàn)中還可以看出在LPS注射7天后，局部炎性因子含量仍較高，說明黑質(zhì)內(nèi)單次注射LPS可以產(chǎn)生較長(zhǎng)時(shí)間的炎癥反應(yīng)。
　　大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS可通過ERK1/2通路和MAPK通路介導(dǎo)

19、炎癥反應(yīng)，并增加BBB的通透性。因此我們提出3-AB是否通過ERK1/2通路和MAPK通路抑制LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)BBB和DA能神經(jīng)元。在本研究中，westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS顯著提高p-ERK1/2和p-p38MAPK的表達(dá)水平，各組腦組織中ERK1/2和p38MAPK的表達(dá)無明顯變化。給予3-AB明顯抑制了p-ERK1/2的表達(dá)，而增加了p-p38MAPK的表達(dá)。以上結(jié)果提示，3-AB對(duì)LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎

20、癥的保護(hù)作用中，ERK1/2通路和MAPK通路發(fā)揮了不同的作用。
　　結(jié)論
　　1、LPS黑質(zhì)注射可導(dǎo)致BBB通透性增加，DA能神經(jīng)元缺失。
　　2、PARP抑制劑3-AB可降低BBB通透性，保護(hù)DA能神經(jīng)元。
　　3、3-AB顯著抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　4、LPS使p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著增加，3-AB顯著降低LPS誘導(dǎo)的p-ERK1/2的表達(dá)