表皮葡萄球菌細(xì)胞壁錨定表面蛋白SesI在致病中的作用.pdf

1、目的：
　　表皮葡萄球菌是廣泛定植于人類皮膚和粘膜的共生菌，很少引起臨床顯著感染，然而，隨著體內(nèi)醫(yī)用材料植入（包括導(dǎo)管、心臟瓣膜、血管移植和假體植入等）的增加，表皮葡萄球菌逐漸成為醫(yī)院獲得性感染的主要的條件致病菌。與金黃色葡萄球菌相比，表皮葡萄球菌產(chǎn)生的毒力因子相對(duì)較少，其致病作用主要與其生物膜的形成能力有關(guān)。表皮葡萄球菌分泌的細(xì)胞壁錨定表面蛋白含有LPXTG模序，可以通過轉(zhuǎn)肽酶A共價(jià)連接到細(xì)菌的細(xì)胞壁上，是引起醫(yī)用材料相關(guān)感染的

2、主要致病因素。目前已發(fā)現(xiàn)11種含有LPXTG模序的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，但是只有5種含LPXTG模序的蛋白（Aap、Bhp、SdrF、SdrG、SesC）在表皮葡萄球菌感染和生物膜形成中的致病機(jī)制被研究。表皮葡萄球菌表面蛋白I（SesI）被認(rèn)為是表皮葡萄球菌相關(guān)感染的主要致病因子，但其致病機(jī)制并不清楚，本研究旨在為了解表面蛋白SesI在表皮葡萄球菌相關(guān)感染和生物膜形成中作用。
　　方法：
　　根據(jù)表皮葡萄球菌RP62A全基因組測(cè)序

3、結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR法擴(kuò)增sesI基因上、下游同源臂片段，利用引入的特異酶切位點(diǎn)KpnI，通過T4酶連作用首先將上、下游連接起來，此片段即為sesI基因缺失的同源臂片段。然后與溫度敏感性穿梭質(zhì)粒pKOR1在BP反應(yīng)酶作用下發(fā)生重組反應(yīng)，形成同源重組質(zhì)粒pKOR1-△sesI。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DC10B進(jìn)行修飾后，電轉(zhuǎn)入表皮葡萄球菌RP62A感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)過一系列的變溫傳代、四環(huán)素誘導(dǎo)及抗生素篩選，并通過基因水平（酶切及PC

4、R擴(kuò)增）和轉(zhuǎn)錄水平（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）以及測(cè)序結(jié)果鑒定，最終確定sesI基因敲除成功。為了排除在突變株構(gòu)建過程中引起的二次突變?cè)斐蓪?duì)表型研究結(jié)果的影響，構(gòu)建了sesI基因回復(fù)突變株。擴(kuò)增sesI基因及上游的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合區(qū)域，通過特異酶切位點(diǎn)將回復(fù)的基因片段與表達(dá)載體pRB473連接，經(jīng)大腸埃希菌DC10B修飾后電轉(zhuǎn)入缺失突變株中，經(jīng)PCR鑒定及測(cè)序結(jié)果證實(shí)回復(fù)株構(gòu)建成功。sesI基因缺失突變株及回復(fù)株構(gòu)建成功后，檢測(cè)三種菌株（表

5、皮葡萄球菌RP62A、表皮葡萄球菌RP62A△sesI和表皮葡萄球菌RP62A△sesI-C）的生長(zhǎng)情況,體外起始粘附能力和聚集能力的變化，生物膜半定量檢測(cè)成熟階段生物膜形成能力的差異，并通過TritonX-100誘導(dǎo)的自溶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自溶能力的變化。
　　結(jié)果：
　　將表皮葡萄球菌RP62A的sesI基因上、下游片段通過特異酶切位點(diǎn)連接后，形成上下游同源臂片段約2220bp大小片段。同源臂片段兩端分別引入attB1和attB2

6、序列，與溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKOR1的特異位點(diǎn)attP1和attP2在BP反應(yīng)酶作用下，形成重組質(zhì)粒pKOR1-△sesI。重組質(zhì)粒pKOR1-△sesI經(jīng)大腸埃希菌DC10B的修飾后，電轉(zhuǎn)入表皮葡萄球菌RP62A野生株中。經(jīng)過變溫傳代使重組質(zhì)粒與表皮葡萄球菌RP62A發(fā)生同源重組，經(jīng)脫水四環(huán)素誘導(dǎo)篩選出sesI基因缺失突變株。通過PCR驗(yàn)證和測(cè)序分析最終確認(rèn)sesI基因敲除株構(gòu)建成功。構(gòu)建sesI基因的互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒pRB473-ses

7、I,然后電轉(zhuǎn)入缺失突變株中，經(jīng)鑒定回復(fù)株構(gòu)建成功。為了排除細(xì)菌生長(zhǎng)變化對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，繪制野生株、sesI基因缺失突變株以及回復(fù)株的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)sesI基因的缺失及回復(fù)并未影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。通過體外起始粘附實(shí)驗(yàn)研究sesI基因在生物膜形成過程中的起始階段的作用，發(fā)現(xiàn)sesI基因缺失后其粘附能力降低了29.0％，與野生株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而sesI突變回復(fù)株基本回復(fù)了野生株的粘附水平。通過聚集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sesI

8、基因敲除株的細(xì)菌分布比較散在、稀疏，表皮葡萄球菌RP62A野生株及sesI突變回復(fù)株的細(xì)菌分布比較聚集重疊，兩者具有明顯差異。通過半定量的生物膜形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同細(xì)菌分別在不同生長(zhǎng)環(huán)境下（4%NaCl、4%乙醇和0.5%葡萄糖）的成熟階段生物膜形成能力，發(fā)現(xiàn)各個(gè)菌株之間并沒有明顯差異（P＞0.05）。生物膜掃描電鏡顯示，三種菌株在成熟階段的生物膜均相互重疊堆積形成致密團(tuán)塊，sesI基因的敲除并未明顯影響生物膜的形成能力。TritonX-1