cDDP、5-FU誘導耐藥性產生過程中細胞株BGC-823、LoVo的hMSH2、hMLH1表達變化.pdf

1、目的：胃癌、大腸癌是我國常見的惡性腫瘤。二者在臨床發(fā)現(xiàn)時多為晚期階段，手術后常有轉移，因此，化療成為必要的治療手段。然而，腫瘤細胞產生對化療藥物的耐藥性影響了化療的治療效果。盡管近年對腫瘤耐藥性逆轉的研究很多，但由于腫瘤耐藥性發(fā)生的機制不清楚，故到目前為止尚無令人振奮的成果出現(xiàn)。目前認為腫瘤耐藥性產生的直接機制是腫瘤細胞中一些與抵抗藥物有關的蛋白表達增強。這些蛋白或能將化療藥物排出細胞，使細胞內有效藥物濃度下降以致不能發(fā)揮殺傷作用，或能

2、降低藥物毒性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了十余種這類蛋白，包括：P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)、肺耐藥相關蛋白(LRP)、谷胱苷肽-S-轉移酶-π(GST-π)等，它們在不同腫瘤及腫瘤對不同化療藥物的耐藥產生過程中發(fā)揮作用。然而，較少有人研究腫瘤細胞產生及上調這些蛋白表達的機制。同正常細胞特別是不穩(wěn)定細胞一樣，腫瘤細胞也需要基因修復系統(tǒng)，以修復各種原因引起的基因損傷。錯配修復(Mismatch Repair，MMR)系統(tǒng)就是其中之一，它

3、可以糾正DNA復制過程中發(fā)生的堿基錯配，維持基因組穩(wěn)定。該系統(tǒng)功能喪失時，DNA復制過程中發(fā)生的錯配得不到修復，基因組突變聚積，易變性增加，致使基因表達紊亂。這是胃癌、大腸癌、子宮內膜癌等一些不穩(wěn)定細胞來源惡性腫瘤發(fā)生的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥性產生過程中也常伴有MMR系統(tǒng)功能異常。那么腫瘤耐藥性產生是否與MMR系統(tǒng)功能缺失引起的基因不穩(wěn)定性所導致的耐藥相關基因表達紊亂有關呢?本研究通過檢測胃癌細胞株BGC-823、大腸癌細胞株LoV

4、o在順鉑(cDDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導耐藥性產生過程中耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π和錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1的表達變化，分析二者表達的關系，探討胃腸道癌耐藥性產生的機制。 方法：1．胃癌耐藥細胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU及大腸癌耐藥細胞株LoVo/5-FU的建立和它們耐藥指數的測定：①采用小劑量、逐步遞增cDDP濃度，間歇作用體外誘導法，建立胃癌耐藥細胞株BGC-8

5、23/cDDP：采用大劑量沖擊，逐步遞增5-FU濃度，間歇作用體外誘導法，建立胃癌耐藥細胞株BGC-823/5-FU；采用5-FU大劑量間斷沖擊法，建立大腸癌耐藥細胞株LoVO/5-FU。②用MTT法檢測耐藥細胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU、LoVo/5-FU的耐藥指數。2.耐藥蛋白表達的檢測：用免疫細胞化學法和W娓stem·blot法檢測胃癌細胞株BGC-823及其耐藥細胞株BGC-823/eDDP、BGC-8

6、23/5-FU和大腸癌細胞株LoVo及其耐藥細胞株LoVo/5-FU的耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π表達情況，比較親本株與耐藥株這些蛋白表達的差異。3.錯配修復蛋白表達的檢測：用免疫細胞化學法檢測胃癌細胞株BGC-823及其耐藥細胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU和大腸癌細胞株LoVo及其耐藥細胞株LoVo/5-FU的錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1表達情況，比較親本株與耐藥株這兩個蛋白表達的差異。

7、 結果：1．耐藥細胞株及其耐藥指數：①歷時約8個月耐藥培養(yǎng)，獲得胃癌耐藥細胞株BGC-823/cDDP，其對cDDP的耐藥指數為3.93。②歷時約4個月耐藥培養(yǎng)，獲得胃癌耐藥細胞株BGC-823/5-FU，其對5-FU的耐藥指數為8.21。③歷時約4個月耐藥培養(yǎng)，獲得大腸癌耐藥細胞株LoVo/5-FU，其對5-FU的耐藥指數為10.26。2.耐藥蛋白表達：①胃癌細胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/cDDP：免疫細胞化學法

8、檢測示耐藥蛋白LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達，但在耐藥株的表達明顯強于親本株。②胃癌細胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/5-FU：免疫細胞化學法檢測示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達，但在耐藥株的表達明顯強于親本株；Western·blot法檢測示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達，但耐藥株明顯強于親本株。③大腸癌細胞株LoVo與其耐藥株LoVo

9、/5-FU：免疫細胞化學法檢測示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達，但在耐藥株的表達明顯強于親本株；Western-blot法檢測示耐藥蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在親本株與耐藥株均有表達，但耐藥株明顯強于親本株。3.錯配修復蛋白表達：①胃癌細胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/cDDP：免疫細胞化學法檢測示錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達，但hMSH2表達

10、在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達在親本株和耐藥株間未見明顯差異。②胃癌細胞株BGC-823與其耐藥株BGC-823/5-FU：免疫細胞化學法檢測示錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達，但hMSH2表達在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達在親本株和耐藥株間未見明顯差異。③大腸癌細胞株LoVo及其耐藥株LoVo/5-FU：免疫細胞化學法檢測示錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1在親本株與耐藥株均有表達，但hM

11、SH2表達在耐藥株明顯弱于親本株，而hMLH1表達在親本株和耐藥株間未見明顯差異。細胞株BGC-823、LoVo耐藥產生后，錯配修復蛋白表達呈相同模式。 結論：1.化療藥物作用前，胃癌、大腸癌細胞株BGC-823、LoVo已有P-gP、MRP、L,RP、GST-π的表達，表明P-gP、MRP、LRP、GST-π與消化道腫瘤原發(fā)耐藥性有關。2．胃癌細胞對cDDP產生耐藥的機制可能是LRP、GST-π蛋白的表達。3．胃癌、大腸癌細胞