結(jié)腸癌細(xì)胞株COX-2、hMLH1、hMSH2和P-P38MAPK的表達(dá)及非甾體類抗炎藥的抑癌機(jī)制研究.pdf

1、目的：胃腸道腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其中結(jié)腸癌是人類死亡的第三大原因，死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，是當(dāng)前最常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌的發(fā)生是多因素、多基因變化及多階段發(fā)展的過(guò)程，對(duì)結(jié)腸癌的有效防治和對(duì)癌變的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是降低其發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。 業(yè)已表明，結(jié)腸癌的發(fā)生是多途徑的，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究顯示，環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是合成前列腺素的限速酶，通過(guò)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、

2、分化，抑制細(xì)胞凋亡等途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。COX-2蛋白正常組織不表達(dá)，在大部分結(jié)腸癌組織中表達(dá)增高，而在有錯(cuò)配修復(fù)酶(Mismatchrepairenzyme，MMR)缺陷、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)的結(jié)腸癌組織中表達(dá)減少。提示錯(cuò)配修復(fù)酶的缺失與COX-2蛋白表達(dá)可能在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮不同的作用。 錯(cuò)配修復(fù)酶是DNA修復(fù)系統(tǒng)中重要的工具酶，其功能主要是修復(fù)錯(cuò)誤配對(duì)的堿基。MRR超家族有9種錯(cuò)配修復(fù)酶，其中以人類mut-s同系物1

3、(humanmut-1homologue1，hMLH1)和人類mut-s同系物2(humanmut-shomologue2，hMSH2)功能最重要，二者在很多腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)缺失或降低，是引起基因組MSI發(fā)生的直接原因，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 COX-2、MMR的改變常伴有腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路變化。絲裂原活化蛋白激酶通路(mitigen-activatedproteinkinase，MAPKs)是一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，在腫瘤的發(fā)

4、生、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、缺血再灌注損傷及免疫調(diào)控等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。其中P38絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activatedproteinkinase，P38MAPK)通路是1993年發(fā)現(xiàn)的一類新的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，P38MAPK表達(dá)和活性的變化可有效調(diào)節(jié)該信號(hào)通路，通過(guò)不同的靶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與對(duì)COX-2及花生四烯酸代謝的調(diào)控，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。而且P38MAPK還在細(xì)胞惡變和腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)

5、程中起促進(jìn)作用[3]。但也有不少研究結(jié)果表明，P38MAPK同時(shí)存在抵抗凋亡和增強(qiáng)細(xì)胞存活幾率的功能，這說(shuō)明P38MAPK通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)中可能存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，由反饋途徑影響其產(chǎn)生不同效應(yīng)。 非甾體類抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs，NSAIDs)是臨床上常用的抗炎鎮(zhèn)痛藥，流行病學(xué)調(diào)查顯示NSAIDs對(duì)結(jié)腸癌具有預(yù)防和治療作用[4]。其機(jī)制主要通過(guò)抑制COX-2發(fā)揮抗腫瘤作用，還可通

6、過(guò)激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中P38MAPK來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但是對(duì)于COX-2低表達(dá)的腫瘤，NSAIDs是否有意義，尚不十分清楚。為探討COX-2、hMLH1、hMSH2和P-P38MAPK之間的關(guān)系，本研究分別檢測(cè)了COX-2高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和COX-2低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T細(xì)胞中COX-2、hMLH1、hMSH2和P-P38MAPK的表達(dá)，應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑和非選擇性抑制劑及P38MAPK特異性抑制

7、劑作為干預(yù)因素探討NSAIDs除COX-2以外的抗腫瘤作用機(jī)制，以期為結(jié)腸癌的預(yù)防、發(fā)生和合理治療提供理論依據(jù)。 材料與方法：1材料：選用人COX-2高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株LS-174-T體外培養(yǎng)；應(yīng)用P38MAPK特異性抑制劑SB203580(SB)、COX-2選擇性抑制劑celecoxib和非選擇性抑制劑indomethacin作為干預(yù)因素。 2方法：首先用MTT法檢測(cè)NSAIDs對(duì)細(xì)胞增殖

8、的影響，選擇合適的藥物濃度進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。分別將HT-29細(xì)胞和LS-174-T細(xì)胞均隨機(jī)分為四組，即對(duì)照組(CON)、celecoxib組(C組)和indomethacin組(Ⅰ組)、P38MAPK特異性抑制劑SB組(SB組)、SB和NSAIDs共同作用組(SB+C組和SB+Ⅰ組)。各組細(xì)胞給予不同藥物作用48h，離心收集細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞的總蛋白和RNA。應(yīng)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)技術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖情況；應(yīng)用蛋白免疫印跡(

9、WesternBlot)方法檢測(cè)細(xì)胞株COX-2、hMLH1和hMSH2、P-P38MAPK蛋白的表達(dá)情況；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetransecriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞株COX-2mRNA、hMLH1mRNA、hMSH2mRNA、P-P38MAPKmRNA的表達(dá)情況。 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SAS6.12軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。MTT法檢測(cè)結(jié)果采用兩樣本S

10、tudent's-t檢驗(yàn)，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果、Westernblot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用方差分析法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。 結(jié)果：1NSAIDs對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MTT法測(cè)定顯示，celecoxib對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為70μmol/L，indomethacinIC50濃度為600μmol/L(Table.2)。celecoxib對(duì)LS-174-T細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50濃度為80μmol/L，i

11、ndomethacinIC50濃度為600μmol/L。celecoxib和indomethacin對(duì)HT-29和LS-174-T細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，溶劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)未見明顯影響。 2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 選擇藥物的半數(shù)抑制濃度分別培養(yǎng)細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況并作細(xì)胞周期分析。非甾體類抗炎藥均可誘導(dǎo)兩種細(xì)胞株凋亡，凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)；而P38MAP

12、K特異性抑制劑SB組細(xì)胞凋亡率明顯低于非甾體類抗炎藥組(P＜0.05)，與對(duì)照組相比未見明顯差別；非甾體類抗炎藥和SB共同作用細(xì)胞凋亡率介于非甾體類抗炎藥組和SB組之間，高于對(duì)照組，差異顯著(P＜0.05)。COX-2高表達(dá)HT-29細(xì)胞：COX-2選擇性抑制劑celecoxib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(40.95±0.83)明顯高于COX-2非選擇性抑制劑indomethacin組(24.27±0.98)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

13、(Table.4)。COX-2選擇性抑制劑與非選擇性抑制劑對(duì)COX-2低表達(dá)LS-174-T細(xì)胞的作用未見明顯差別(P＞0.05)(Table.5)。對(duì)于細(xì)胞周期的影響，與對(duì)照組相比，非甾體類抗炎藥組、SB+C組和SB+Ⅰ組均可使兩種細(xì)胞的G0/G1期比例增加，S期比例降低(P＜0.05)，但對(duì)G2/M期無(wú)明顯影響(P＞0.05)。 3應(yīng)用WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞株COX-2、hMLH1、hMSH2和P-P38MAPK基因

14、蛋白表達(dá)情況。 結(jié)論：1結(jié)腸癌細(xì)胞株在NSAIDs和P38MAPK特異性抑制劑SB203580作用后COX-2、hMLH1、hMSH2和P38MAPK在蛋白和基因水平上的表達(dá)是一致的。 2結(jié)腸癌細(xì)胞株hMLH1和hMSH2兩種蛋白表達(dá)的總體缺失與COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平間呈顯著負(fù)相關(guān)，即COX-2高表達(dá)的細(xì)胞中，未見錯(cuò)配修復(fù)酶hMLH1、hMSH2缺失，而兩種蛋白表達(dá)缺失主要發(fā)生在COX-2低蛋白表達(dá)的細(xì)胞中，提示CO

15、X-2、hMLH1、hMSH2影響結(jié)腸癌作用途徑不同。 3研究顯示NSAIDs可激活P38MAPK，以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；P38MAPK是COX-2上游激酶，參與調(diào)控COX-2的表達(dá)，而COX-2又對(duì)P38MAPK有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。 4NSAIDs抗腫瘤作用機(jī)制在于通過(guò)抑制COX-2活性及前列腺素的合成而抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)還可激活COX-2上游激酶P38MAPK，通過(guò)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)磷酸化P38MAPK的表達(dá)，從