胃癌耐藥細(xì)胞株BGC823-5-FU的建立及米非司酮逆轉(zhuǎn)其耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、胃癌(gastric cancer)是人類最常見的惡性腫瘤之一。由于早期胃癌多發(fā)病隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)大部分已處于進(jìn)展期，需給予綜合治療，包括手術(shù)、放療、化療和生物治療等，化療在上述治療中占有重要地位。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是最常用的胃癌化療藥物，然而臨床上應(yīng)用5-FU一段時(shí)間后胃癌細(xì)胞對(duì)其敏感性降低，同時(shí)對(duì)不同種類的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性。因此研究胃癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制有助于尋找逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥的

2、新方法，從而為胃癌臨床治療提供理論依據(jù)。本文以低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823為研究模型，在建立5-Fu誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU的基礎(chǔ)上，研究了該細(xì)胞株生物學(xué)特性、其多藥耐藥發(fā)生及耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。 主要研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)果如下： 一、胃癌耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU的建立及其生物學(xué)特性 采用反復(fù)大劑量沖擊結(jié)合逐步遞增藥物濃度法建立了國(guó)人低分化胃腺癌耐藥細(xì)胞株BGC823/5-Fu，倒置顯微鏡

3、觀察了耐藥株BGC823/5-FU生物學(xué)特征的變化，MTT法測(cè)定了BGC823/5-FU耐藥指數(shù)及交叉耐藥性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在反復(fù)大劑量應(yīng)用5-FU沖擊結(jié)合逐步遞增藥物濃度法誘導(dǎo)后，BGC823/5-FU細(xì)胞較BGC823細(xì)胞胞體略增大，胞核增大，形狀更為不規(guī)則，并可見散在的多核瘤巨細(xì)胞，BGC823/5-FU細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥倍數(shù)為574倍，此細(xì)胞對(duì)各類臨床常用化療代表藥物ADM(蒽環(huán)類)，ACR(蒽環(huán)類)，MMC (抗生素類)，VCR

4、(長(zhǎng)春堿類)，HHT(三尖杉酯堿類)，VP-16(鬼臼毒素類)和DDP(鉑類)也分別具有4.08、6.33、2.11、44.47、63.18、9.52和2.57倍的交叉耐藥性。同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823/5-FU細(xì)胞表面P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度，結(jié)果表明，BGC823/5-FU細(xì)胞P-gp的表達(dá)較其親本細(xì)胞BGC823顯著上升，細(xì)胞蓄積DNR的能力卻明顯下降，穩(wěn)定三個(gè)月后其耐

5、藥特性不變。因此，成功建立了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的人低分化胃腺癌耐藥細(xì)胞株BGC823/5-Fu，該細(xì)胞株的建立為深入研究人低分化胃腺癌多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 二、孕激素拮抗劑米非司酮對(duì)BGC823/5-FU耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究 為研究米非司酮(mifepristone，MIF)可否逆轉(zhuǎn)BGC823/5-FU細(xì)胞的多藥耐藥性，用MTT法觀察不同濃度的MIF對(duì)BGC823和BGC823/5-FU細(xì)胞增殖的影響，以及MIF

6、對(duì)BGC823/5-FU細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，發(fā)現(xiàn)MIF能夠有效逆轉(zhuǎn)BGC823/5-FU的多藥耐藥。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MIF作用BGC823/5-FU細(xì)胞前后P-糖蛋白表達(dá)和細(xì)胞柔紅霉素蓄積濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MIF作用于BGC823/5-FU后P-gp的表達(dá)明顯下降，積累DNR的能力顯著提高，表明MIF可通過降低P-糖蛋白表達(dá)、減少藥物的外排逆轉(zhuǎn)BGC823/5-FU多藥耐藥性。MIF有望成為一種有價(jià)值的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。 三、胃癌細(xì)

7、胞多藥耐藥及逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究 為探討胃癌細(xì)胞BGC823/5-FU多藥耐藥及MIF逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥性的機(jī)制，我們用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)了編碼代謝酶的基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多藥耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU TS和OPRT表達(dá)較親本細(xì)胞BGC823降低，MIF作用BGC823/5-FU細(xì)胞后TS和OPRT表達(dá)升高；BGC823、BGC823/5-FU和MIF作用的BGC823/5-FU細(xì)胞均沒有檢測(cè)到TKm

8、RNA的表達(dá)。RT-PCR法檢測(cè)了耐藥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGC823/5-FU細(xì)胞MRP4、MRP5和MPR8表達(dá)較BGC823升高，經(jīng)MIF作用BGC823/5-FU細(xì)胞后MRP4、MRP5和MPR8表達(dá)降低。BGC823、BGC823/5-FU和MIF作用的BGC823/5-FU細(xì)胞均未檢測(cè)到MRPl mRNA的表達(dá)。RT-PCR法檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，與BGC823細(xì)胞相比，多藥耐藥細(xì)胞BGC823/5-

9、FU Runx3表達(dá)明顯下降，Survivin和GcS表達(dá)顯著升高，經(jīng)MIF作用后BGC823/5-FU細(xì)胞Runx3和GcS表達(dá)明顯升高，Survivin表達(dá)明顯下降。免疫組化法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax和Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BGC823/5-FU細(xì)胞Bax和Caspase-3的表達(dá)較BGC823細(xì)胞顯著下調(diào)，bcl-2的表達(dá)明顯上調(diào)；經(jīng)MIF作用后BGC823/5-FU細(xì)胞Bax和Caspase-3表達(dá)明顯升高