生物信息學(xué)篩選的合成小肽抑制VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管實驗研究.pdf

1、血管新生,即在預(yù)先存在的血管中長出新生毛細(xì)血管的過程.它是多種致盲性新生血管性眼病的共同病理生理基礎(chǔ).血管新生嚴(yán)格地受到促血管因子和抑血管因子平衡的調(diào)控.這種平衡的打破,能夠促發(fā)血管新生的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生、遷移和存活,從而導(dǎo)致病理性的血管新生.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor,vEGF),作為復(fù)雜的血管新生瀑布反應(yīng)的中心介質(zhì)和強大的通透性因子,是迄今為止唯一被

2、證實僅對內(nèi)皮細(xì)胞特異性作用的促血管因子,并在血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用. Kringle結(jié)構(gòu)域是一種由約80個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu),包含三對二硫鍵,是行使生物學(xué)功能的獨立折疊單元.現(xiàn)已證實,Kringle結(jié)構(gòu)域存在于包括生長因子、蛋白酶和凝血因子等多種不同功能的蛋白質(zhì),如纖溶酶原中.Kringle結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是首個特異性抑制血管生長的保守結(jié)構(gòu)的組成部分,許多Kringle結(jié)構(gòu)域能夠抑制血管新生,如纖溶酶原:Kringle 5.

3、 脂蛋白(lipoprotein)是血漿中的脂質(zhì)與特殊蛋白質(zhì)結(jié)合的球狀巨分子復(fù)合物,脂蛋白中的蛋白質(zhì)即載脂蛋白(apolipoprotein).脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)],含有載脂蛋白B100(ApoBlOO)和載脂蛋白(a)[Apo(a)]兩類載脂蛋白.在包含Kringle結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中,載脂蛋白(a)(apolipoprotein(a),apo(a))包含幾個隨機重復(fù)的與纖溶酶原Kringle 4類

4、似的Kringle區(qū)域(Kringle Ⅳ),后面帶有一個與纖溶酶原Kringle 5同源的Kringle Ⅴ結(jié)構(gòu)域以及蛋白酶區(qū)域.已有一些研究揭示,apo(a)的這些結(jié)構(gòu)也有類似于纖溶酶原相關(guān)Kringle結(jié)構(gòu)域的抗新生血管活性,但apo(a)發(fā)揮抗血管新生活性的關(guān)鍵區(qū)域尚未得到清楚的闡明.因此,確定各結(jié)構(gòu)域的抗血管新生活性位點及其潛在機制,對于更深入地認(rèn)識包含多Kringle結(jié)構(gòu)的血管生成抑制劑的功能具有重要意義. 出于此目

5、的,我們選擇apo(a)中與纖溶酶原K5唯一同源的KV結(jié)構(gòu)域,應(yīng)用生物信息學(xué)手段分析預(yù)測其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,篩選出其中的一個11肽片段YTMNPRKLFDY,人工合成后觀察其對VEGF誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管的作用,初步探討apo(a)抗新生血管活性區(qū)域所在,并為進一步開發(fā)治療眼部新生血管疾病的分子藥物奠定基礎(chǔ). 第一部分生物信息學(xué)分析篩選小肽 目的:利用生物信息學(xué)的方法,對apo(a)KV的氨基酸序列進行分析

6、,預(yù)測其抗新生血管的活性氨基酸位點所在. 方法:登陸美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站主頁(http://www.ncbi.nlm.nih.zov/),進入NCBI默認(rèn)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NRDB蛋白質(zhì)序列復(fù)合數(shù)據(jù)庫,查詢"apolipoprotein(a)kringle V".進入網(wǎng)站中的StandardProtein-Protein

7、BLAST(BLASTp)子程序,提交查得的apo(a)KV氨基酸序列.打開Lasergene軟件包,進入Protean程序,進行抗原性、表面接觸性分析和氨基酸組成分析;打開BioEdit軟件包,行氨基酸組成分析和疏水面平均數(shù)的計算.綜合分析上述結(jié)果. 結(jié)果:在NRDB蛋白質(zhì)序列復(fù)合數(shù)據(jù)庫中查找得到人apo(a)apo(a)KV(4227-4327)序列如下:DCMF GNGKGYRGKK ATTVTGTPCQEWAAQEPHR

8、H STFIPGTNKW AGLEKNYCRN PDGDINGPWC YTMNPRKLFDYCDIPLCASS SFDCGKPQVE PKKCPGS.BLAST程序分析該序列顯示了apo(a)KV與纖溶酶原K5含有85﹪的相同氨基酸殘基,91﹪的相似氨基酸殘基(Expect=le-51).推測apo(a) KV中保守氨基酸分布較集中的區(qū)域可能存在抗新生血管活性位點.根據(jù)上述同源性比較結(jié)果,結(jié)合apo(a)KV空間結(jié)構(gòu),以二硫鍵為界,將a

9、po(a)KV分成4個肽段,依次為Pept 1～Pept 4,分別進行生物學(xué)特性分析.抗原性分析顯示,在apo(a)KV第5-15、50-60、65-75、90-100氨基酸殘基區(qū)域出現(xiàn)較大的抗原性波峰,這些區(qū)域分別位于Pept 1大部分、Pept 3前段和Pept4全段.在表面接觸性分析中,在apo(a) KV第10-15、30-35、65-75、90-95氨基酸殘基區(qū)域出現(xiàn)表面接觸性波峰,對應(yīng)的區(qū)域為Pept 1中段、Pept 2前

10、段和Pept 4全段.疏水性分析顯示,Pept 3和Pept 4各形成一個親水性谷底.Pept 1-Pept 4中疏水性氨基酸(AILFWV)所占分子量的比重依次為15.33﹪、29.10﹪、24.16﹪和18.00﹪. 結(jié)論:在apo(a) KV的各個肽段中,Pept 4含有較大比例的保守殘基,且較其他三個肽段有良好的反應(yīng)特性,包括抗原性、表面接觸活性和親水性等,故推測Pept 4,即小肽YTMNPRKLFDY,可能與apot

11、(a)KV的抑制活性有關(guān),具有抗新生血管的作用. 第二部分小鼠角膜微囊袋模型的建立 目的:以含有vEGF的緩釋顆粒作為直接刺激因子誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管,建立小鼠角膜微囊袋非炎癥性新生血管模型. 方法:將12﹪PolyHEMA乙醇溶液與含有硫糖鋁粉術(shù)的生理鹽水溶液等體積混合后制成0.35mm×0.35 mm大小的空白緩釋顆粒,并在上述顆粒中加入160 ng VEGF,形成含有160ng/粒的VEGF緩釋顆粒.無菌條

12、件下,在實驗眼角膜基質(zhì)層間行鈍性分離,將VEGF緩釋顆粒和空白緩釋顆粒分別植入小袋內(nèi).術(shù)后每天觀察實驗眼至角膜新生血管出現(xiàn)后,改為隔日觀察,測定角膜最大新生血管長度、新生血管鐘點數(shù)和新生血管面積,并行小鼠角膜病理組織學(xué)檢查. 結(jié)果:移植有VEGF緩釋顆粒的小鼠角膜,術(shù)后24h內(nèi)手術(shù)部位的角膜上皮趨于愈合,角膜基質(zhì)輕到中度水腫.術(shù)后3d,角鞏緣的血管輕度擴張,開始向移植有VEGF緩釋顆粒的透明角膜生長,未見滲出等炎癥表現(xiàn).術(shù)后5-

13、7d,角膜新生血管逐漸朝向緩釋顆粒生長旺盛,血管迂曲擴張,于術(shù)后7d達(dá)到高峰.術(shù)后8d開始,角膜新生血管不再繼續(xù)生長,開始退化,新生血管叢變稀疏,管腔變細(xì)、萎縮,顏色變淺.移植有空白緩釋顆粒的小鼠角膜,術(shù)后24h內(nèi)手術(shù)部位的角膜上皮趨于愈合,角膜基質(zhì)輕到中度水腫.術(shù)后3d,角膜水腫基本消退,未見滲出等炎癥表現(xiàn),角鞏緣血管未見明顯改變.術(shù)后觀察2w,均未見新生血管生成. 結(jié)論:本實驗所采用的小鼠角膜微囊袋模型,其新生血管直接由VE

14、GF誘導(dǎo),排除了炎癥反應(yīng)的干擾,這對于特定的新生血管抑制劑的療效評價具有重要的意義,同時便于定量分析,穩(wěn)定性和重復(fù)性好. 第三部分合成小肽對VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管作用研究 目的:將生物信息學(xué)篩選的小肽人工合成后,應(yīng)用小鼠角膜微囊袋模型,評價其對VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管的作用. 方法:采用12通道多肽合成儀按照小肽的氨基酸序列編輯程序固相合成小肽,并行高效液相色譜純化.將12﹪PolyHEMA乙醇溶液與含

15、有硫糖鋁粉木的生理鹽水溶液等體積混合后制成0.35mm×0.35 mm大小的空白緩釋顆粒,并在上述顆粒中加入160 ng VEGF和不同劑量的小肽(0μg,0.5μg,1 μg和1.5 μg),及僅加入1μg小肽.每只實驗小鼠均以右眼為實驗眼,按照隨機數(shù)字表法,將50只眼隨機分成5組,每組lO只眼.無菌條件下,在實驗眼角膜基質(zhì)層間行鈍性分離,形成-0.5 mm×0.5 mm小袋,分別植入包含160 ng VEGF與0μg、0.5μg、1

16、.0μg和1.5μg小肽的緩釋顆粒,依次作為對照組、A組、B組和C組,植入1μg小肽的緩釋顆粒作為D組.術(shù)后7 d攝片觀察測定角膜最大新生血管長度、新生血管鐘點數(shù)和新生血管面積,小鼠角膜病理組織學(xué)檢查. 結(jié)果:YTMN:PRKLFDY,是一個包含11個氨基酸殘基的小肽,由于其分子量較小,因而可通過固相合成獲得,并進行HPLC純化,凍干獲得純度大于95﹪的白色粉術(shù),水溶性好.對照組角膜新生血管自角鞏緣朝向緩釋顆粒生長濃密,迂曲擴張

17、.A組角膜新生血管生長旺盛,與對照組比較,在最長血管長度、鐘點數(shù)和面積上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).B組角膜可見短小稀疏的新生血管自角鞏緣生長,管徑較細(xì),與對照組比較,在最長血管長度、鐘點數(shù)和面積上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(JF)<0.01).C組角膜自角鞏緣處未見明顯粗大的新生血管長成,與對照組比較,在最長血管長度、鐘點數(shù)和面積上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與B組比較,在上述3個指標(biāo)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).術(shù)后觀察