新型VEGF靶向抗體FD006抑制角膜新生血管的實驗研究.pdf

1、目的:評價FD006的體外生物學(xué)活性。觀察FD006抑制堿燒傷誘導(dǎo)的大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CoNV)增殖的情況,初步探索FD006抑制大鼠CoNV生長的作用機制。評價FD006在眼部應(yīng)用的安全性并初步探討FD006的眼部藥代動力學(xué)情況。
　　材料與方法:
　　1.借助分子模擬、動態(tài)對接方法研究FD006與VEGF相互作用模式。蛋白-蛋白相互作用和ELISA檢測FD006與VE

2、GF的結(jié)合能力。CCK8檢測FD006對VEGF誘導(dǎo)HUVEC增殖的影響。
　　2.建立堿燒傷誘導(dǎo)SD大鼠CoNV動物模型,堿燒傷術(shù)后第1天,隨機分為:0.9％NaCl、溶劑、地塞米松組、貝伐單抗和FD006抗體5組,各組分別給予結(jié)膜下注射相應(yīng)藥物治療;觀察CoNV生長情況及角膜組織變化,并進行眼前節(jié)照相。分析CoNV的長度及面積。堿燒傷術(shù)后3、7、14、21和28天處死動物,取角膜組織行免疫組織化學(xué)法、Realtime PCR和

3、Western Blot等方法檢測VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、MMP-9以及ICAM-1等基因表達水平。
　　3.CCK8法體外檢測FD006抗體對角膜上皮細胞毒副作用。流式細胞儀檢測FD006對角膜上皮細胞的凋亡影響。正常SD大鼠結(jié)膜下注射FD006抗體,觀察眼部反應(yīng)情況,通過裂隙燈顯微鏡檢查、病理切片等,分析結(jié)膜和角膜病理改變。建立SD大鼠角膜上皮缺損模型,結(jié)膜下注射FD006抗體,觀察角膜上皮愈合情況。

4、　　4.取8~12周齡健康成年新西蘭白兔20只(40眼),結(jié)膜下注射FD006,分別于給藥后第5、7、14、21和28天取房水、玻璃體以及外周血,ELISA法檢測各樣本內(nèi)的藥物濃度,并使用WinNonlin藥代動力學(xué)軟件計算主要的藥代動力學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.FD006與VEGF結(jié)合能力優(yōu)于貝伐單抗。實驗條件下,FD006結(jié)合VEGF的EC50約為0.037μg/mL,貝伐單抗與VEGF結(jié)合的EC50為0.18μg/

5、mL;結(jié)合動力學(xué)分析表明,FD006結(jié)合VEGF的親和力是貝伐單抗的2倍,兩者主要差別在于FD006解離速率慢于貝伐單抗。FD006抗體能顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC的增殖,其IC50值0.031±0.0064μg/mL,優(yōu)于貝伐單抗(0.047±0.0081μg/mL)。
　　2.結(jié)膜下注射地塞米松、貝伐單抗、FD006和對照組相比均能有效抑制CoNV的生長(P<0.01)。溶劑組和0.9%NaCl組CoNV面積和長度沒有顯

6、著差異( P>0.05)。FD006治療組和對照組相比能夠有效降低角膜組織中VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, MMP-9 and ICAM-1的表達。在治療早期,FD006治療組的 CoNV長度和面積較貝伐單抗治療組小(P<0.05);與地塞米松相當(dāng)(P>0.05);在治療后期,FD006組和貝伐單抗組的CoNV長度和面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　3. FD006不影響角膜上皮細胞增殖,不促進角膜上皮細

7、胞的凋亡。結(jié)膜下注射后,大鼠角結(jié)膜及眼部其他各組織形態(tài)正常,組織學(xué)檢查顯示結(jié)構(gòu)正常,未見炎癥細胞浸潤。結(jié)膜下注射FD006不影響角膜上皮愈合。
　　4.結(jié)膜下注射FD006后,在血清和未注射的對側(cè)眼的房水玻璃體內(nèi)均檢測到FD006。在各時間點,注射眼房水、玻璃體中的濃度都相應(yīng)比未注射的對側(cè)眼房水、玻璃體濃度更高。注射眼中玻璃體腔的FD006濃度高于房水。FD006結(jié)膜下注射后在注射眼的房水中半衰期約為10.7天,玻璃體內(nèi)半衰期約為