SFRP2基因甲基化促進(jìn)口腔粘膜鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制研究.pdf

1、口腔粘膜鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的癌癥之一。盡管近年來在治療方法上取得了較大的進(jìn)展，但其五年生存率仍然徘徊在55％～60％。研究發(fā)現(xiàn)吸煙是誘發(fā)OSCC的重要危險(xiǎn)因素之一，而且長(zhǎng)時(shí)間接觸煙草的OSCC患者，治療后復(fù)發(fā)率和第二原發(fā)癌發(fā)生的危險(xiǎn)性也明顯升高。此外，有學(xué)者研究證實(shí)煙草中致癌物質(zhì)可能與OSCC患者DNA甲基化水平有關(guān)。眾所周知，作為一種重要的腫瘤表觀遺傳學(xué)機(jī)

2、制，DNA甲基化水平或模式發(fā)生變化，包括基因組整體甲基化水平降低所導(dǎo)致的原癌基因激活、突變熱點(diǎn)形成、轉(zhuǎn)座子異常表達(dá)以及基因組不穩(wěn)定性等，都會(huì)對(duì)腫瘤的發(fā)生有促進(jìn)作用。
　　Wnt信號(hào)通路與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和形成具有密切的關(guān)系。分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族（secreted frizzled-related proteins，SFRPs）是一種分泌型糖蛋白，能夠通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Wnt蛋白受體或直接與Wnt蛋白結(jié)合，影響該信號(hào)通路的生物學(xué)

3、功能。SFRP2基因是SFRPs家族成員之一，該基因定位于染色體4q31.3，具有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，第1外顯子附近有密度較高的CpG島。研究認(rèn)為，SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化，能夠下調(diào)SFRP2的表達(dá)，從而導(dǎo)致對(duì)Wnt通路的抑制作用減弱，引起細(xì)胞的過度增殖，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。多項(xiàng)研究表明，SFRP2基因甲基化水平與結(jié)腸癌、食管癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。本課題旨在通過以下四個(gè)部分的研究，從體外和體內(nèi)兩個(gè)

4、層次系統(tǒng)探討SFRP2基因甲基化水平在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制。類似研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　第一部分:口腔鱗癌組織中SFRP2基因甲基化的發(fā)生及其臨床意義
　　目的:探討Wnt通路拮抗基因家族分泌型卷曲相關(guān)蛋白——SFRP2基因在口腔鱗癌組織中的甲基化狀態(tài)及其臨床意義。
　　方法:收集2010年10月至2011年8月于蘇州大學(xué)某醫(yī)院口腔科手術(shù)治療、經(jīng)病理確診為OSCC的腫瘤組織49例以及與其相配對(duì)的癌旁

5、正常組織49例。采用甲基化特異PCR法(methylation-specific PCR，MSP)及亞硫酸氫鹽處理后測(cè)序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測(cè)口腔鱗癌及癌旁正常組織中SFRP2基因的甲基化狀態(tài)，分析SFRP2基因甲基化與相應(yīng)臨床病理特征之間的關(guān)系。采用RT-PCR法檢測(cè)SFRP2 mRNA表達(dá)情況，并分析其與SFRP2基因甲基化之間的關(guān)系。
　　結(jié)果: MSP檢測(cè)結(jié)果顯示，口腔鱗癌組織中

6、SFRP2基因甲基化的發(fā)生率為75.51％(37/49)，明顯高于癌旁正常組織(6.12％;3/49)。通過對(duì)BSP產(chǎn)物進(jìn)行克隆和多次核酸序列測(cè)定，進(jìn)一步證實(shí)癌組織中SFRP2基因啟動(dòng)子在CpG島的甲基化程度明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。此外，SFRP2基因甲基化與臨床分期相關(guān)，重度吸煙患者的腫瘤組織中SFRP2基因甲基化的發(fā)生率較高。RT-PCR結(jié)果表明，口腔鱗癌組織中SFRP2 mRNA表達(dá)缺失率為85.71％(42/49)，而

7、相應(yīng)的癌旁組織均有SFRP2 mNRA表達(dá)。37例發(fā)生SFRP2基因啟動(dòng)子甲基化的口腔鱗癌組織中mRNA表達(dá)缺失率為94.59％(35/37)，未發(fā)生SFRP2基因啟動(dòng)子甲基化的癌組織中表達(dá)缺失率為41.67％(5/12)，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論:口腔鱗癌組織中SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，而且其mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。提示該基因的甲基化可能是其基因失活的主要機(jī)制之一，而且吸煙與SFRP2基因的甲基

8、化可能有一定相關(guān)性。
　　第二部分:5-Aza-dC對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113增殖、凋亡及SFRP2基因甲基化的影響
　　目的:觀察5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）對(duì)體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113中SFRP2基因的甲基化狀態(tài)和mRNA表達(dá)的作用，并研究5-Aza-dC對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113的增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:用不同濃度的5-Az

9、a-dC處理體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113。24h后，采用MSP法檢測(cè)、比較5-Aza-dC處理前后SFRP2基因的甲基化狀態(tài);采用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中SFRP2 mRNA及蛋白表達(dá)的變化情況;采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性;采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡的變化。
　　結(jié)果:體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113中SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化，而且SFRP2 m

10、RNA和SFRP2蛋白的表達(dá)均處于較低水平。經(jīng)5-Az-dC處理之后，SFRP2基因甲基化狀態(tài)得到明顯逆轉(zhuǎn)，SFRP2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平也逐漸增加，并呈現(xiàn)出5-Aza-dC藥物濃度依賴性。MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的5-Aza-dC處理后，Tca8113細(xì)胞生存率逐漸下降，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸上升，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，不同藥物濃度處理24h后Tca8113細(xì)胞周期與對(duì)照組相比發(fā)生明顯的G1期阻滯與細(xì)胞凋

11、亡，并同樣呈現(xiàn)藥物濃度依賴關(guān)系。
　　結(jié)論:在人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113中，同樣呈現(xiàn)SFRP2基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化和其mRNA和蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。5-Aza-dC能夠逆轉(zhuǎn)Tca8113細(xì)胞中SFRP2基因的甲基化狀態(tài)，并能恢復(fù)其mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)，5-Aza-dC可抑制Tca8113細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞周期分布，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與該藥物對(duì)SFRP2基因的去甲基化作用有關(guān)。
　　第三部分:SFRP2基因在口

12、腔鱗癌細(xì)胞Tca8113中的生物學(xué)功能及其機(jī)制的研究
　　目的:研究SFRP2基因在Tca8113中的生物學(xué)功能及可能的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究該基因在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:構(gòu)建能夠表達(dá)SFRP2的重組質(zhì)粒pcDNA3.1+/SFRP2，并設(shè)計(jì)、合成SFRP2小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞。采用RT-PCR和West

13、ern Blot法分別檢測(cè)細(xì)胞中SFRP2的mRNA和蛋白的表達(dá)情況，建立高表達(dá)SFRP2的細(xì)胞模型Tca8113/SFRP2和SFRP2基因敲減的體外細(xì)胞模型。采用Western Blot檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況。采用MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)研究該基因?qū)?xì)胞增殖的影響，并采用流式細(xì)胞儀分析SFRP2的表達(dá)水平與細(xì)胞周期分布之間關(guān)系。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+/SFRP2，經(jīng)測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染T

14、ca8113細(xì)胞，通過G418篩選，獲得穩(wěn)定高表達(dá)SFRP2的人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113/SFRP2。同時(shí)，通過對(duì)siRNA的篩選，成功獲得能夠有效抑制Tca8113細(xì)胞中SFRP2表達(dá)的siRNA。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示SFRP2高表達(dá)能夠引起Wnt信號(hào)通路中磷酸化GSK-3β和β-catenin的表達(dá)增加，并降低通路下游關(guān)鍵效應(yīng)因子Cyclin D1的表達(dá)水平;而采用siRNA敲減Tca8113細(xì)胞中SFRP2基因，則

15、能夠?qū)е铝姿峄疓SK-3β和β-catenin表達(dá)水平的下降，但對(duì)Cyclin D1的表達(dá)無顯著影響。此外，SFRP2過表達(dá)可顯著抑制Tca8113細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞周期G1期阻滯;而敲減SFRP2表達(dá)，則能夠促進(jìn)Tca8113細(xì)胞的增殖，并引起細(xì)胞周期S期比率增加。
　　結(jié)論:SFRP2能夠調(diào)控Tca8113細(xì)胞的增殖周期，抑制Tca8113細(xì)胞的體外增殖，其機(jī)制可能部分與影響Wnt信號(hào)通路中信號(hào)蛋白分子GSK-3β，β-ca

16、tenin的磷酸化和Cyclin D1的表達(dá)有關(guān)。
　　第四部分:口腔鱗癌裸鼠移植瘤模型中SFRP2基因功能研究
　　目的:研究在裸鼠中，SFRP2基因?qū)θ丝谇击[癌移植瘤形成的抑制作用及相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:體外培養(yǎng)穩(wěn)定高表達(dá)SFRP2的Tca8113/SFRP2細(xì)胞株和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株Tca8113/pc3.1，并分別將指數(shù)生長(zhǎng)期的上述細(xì)胞接種于20只裸鼠右前肢皮下（每種細(xì)胞株接種10只），建立裸鼠移植瘤模型。

17、成瘤后每3d測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑a和短徑b，按照公式V=ab2π/6計(jì)算瘤體積，繪制腫瘤增殖曲線。第28d安樂死處死動(dòng)物，完整解剖出瘤塊，常規(guī)進(jìn)行固定、石蠟包埋與切片，經(jīng)HE染色觀察其組織病理學(xué)特征，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組標(biāo)本中Ki67、β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功建立Tca8113/SFRP2和Tca8113/pc3.1裸鼠移植瘤模型，形成的體內(nèi)腫瘤具有典型的口腔鱗癌組織病理學(xué)特征。結(jié)果表明，