聯(lián)合檢測CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin甲基化在結(jié)直腸癌篩查中的作用.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)腸直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是最為常見的消化道惡性腫瘤，近幾年隨著生活水平的不斷提高，CRC的發(fā)病率逐年攀升，每年有近百萬新病例被確診，多數(shù)病例在中晚期階段才被診斷，預(yù)后不佳，死亡率高。CRC的早期癥狀不典型，其早期發(fā)現(xiàn)可以顯著改善不良預(yù)后，降低CRC的死亡率，在臨床上具有良好的使用價值。
　　目前臨床上常用的篩查CRC的方式主要包括電子結(jié)直腸鏡和大便潛血試驗（fecal occu

2、lt blood test，F(xiàn)OBT），分別因其是侵入性檢查或陽性檢出率低等缺點而限制了在CRC篩查上的廣泛應(yīng)用。近年來DNA甲基化檢測已成為CRC早期診斷的熱點，很多指南已明確指出甲基化檢測可作為早期CRC篩查的方法。目前，血漿Septin9甲基化試劑盒已廣泛用于臨床，其對CRC的檢出率和特異性均明顯優(yōu)于FOBT檢測。由于腸粘膜表面腫瘤細(xì)胞持續(xù)脫落，所以CRC患者糞便樣本可用于DNA甲基化篩查。大量數(shù)據(jù)表明，糞便DNA甲基化檢測的陽性

3、檢出率和特異性明顯超出血液標(biāo)本的甲基化檢測。
　　單基因糞便DNA甲基化檢測診斷CRC的檢出率和特異性較低，多基因聯(lián)合進(jìn)行甲基化檢測能提高CRC的檢出率。但隨著聯(lián)合檢測基因數(shù)的增多，檢測的成本明顯加大，高成本的檢測方法不適用于大范圍的CRC的篩查，因此在尋找具有高陽性檢出率和特異性的同時，探索可降低檢測成本的少部分的最適基因組合，是亟待解決的問題，這將對CRC篩查具有重大意義。因此，本研究擬將與CRC具有甲基化診斷標(biāo)志物高潛能的V

4、imentin和SFRP2基因和新近發(fā)現(xiàn)的具有高潛能的CNRIP1和SNCA甲基化基因聯(lián)合檢測，通過不同的組合以確定陽性檢出率和特異性，以期達(dá)到對CRC篩查的最佳組合。
　　目的：
　　1.明確CRC、腺瘤、增生性息肉和正常病例對照組糞便DNA提取物中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin四個基因單獨的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)；并分析其與臨床病理資料的相關(guān)性。
　　2.探討不同基因組合進(jìn)行檢測時甲基化陽性檢出率

5、之間的差異，選出具有高陽性檢出率、特異性及較低檢測成本的基因組合，明確多基因聯(lián)合的甲基化狀態(tài)用于CRC早期篩查的意義。
　　3.驗證最優(yōu)基因組合篩選CRC的臨床敏感性及特異性，明確其與FOBT檢測及糞便商品化試劑盒檢測等篩查方法的優(yōu)缺點。
　　方法：
　　1.單基因甲基化檢測實驗所需的糞便樣本取自60例CRC病人、30例腺瘤病人、20例增生性息肉病人、25例陰性對照人群，采用MS-PCR技術(shù)分析CNRIP1、SNCA、

6、SFRP2、Vimentin四個基因的單基因檢測甲基化情況，通過SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗，分析這四個基因與CRC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，并比較四個基因單獨甲基化檢測與FOBT結(jié)果之間的差異。
　　2.應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對比兩個基因聯(lián)合、三個基因聯(lián)合、四個基因聯(lián)合等不同組合的甲基化檢測的檢出率及特異性差異，篩選出兼顧陽性檢出率和特異性的最佳基因組合。
　　3.用CRC診療指南中的高危人群條件

7、作為標(biāo)準(zhǔn)，從住院病人中篩選出200名患者，作為臨床驗證的對象，采用糞便DNA甲基化檢測方法對篩選出的最佳基因組合進(jìn)行臨床驗證。同時將200名患者的糞便標(biāo)本應(yīng)用大腸癌商品化試劑盒進(jìn)行檢測，對比兩者的臨床敏感性及特異性。
　　結(jié)果：
　　1. CRC糞便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因啟動子甲基化陽性檢出率分別為73.3％、60%、76.7%、81.7%，腺瘤患者分別為56.7%、46.7%、63

8、.3%、60%，增生性息肉患者分別為20.0%、15.0%、10.0%、20.0%，正常對照人群分別為8.0%、4.0%、4.0%、12.0%，特異性分別為92.0%、96.0%、96.0%、88%，CRC患者和腺瘤患者之間無顯著的差異，但與增生性息肉組、正常對照組存在顯著性差異（P<0.05）。
　　2. CRC患者糞便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因的甲基化程度與性別、年齡、癌變部位、病變分期、

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)性。
　　3.兩個基因聯(lián)合檢測時，CNRIP1和SNCA聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為85.0%， SFRP2和Vimentin聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為91.7%，CNRIP1和SFRP2聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為91.7%，CNRIP1和Vimentin聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為93.3%，SNCA和SFRP2聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為83.3%，SNCA和Vimentin聯(lián)合

10、檢測CRC的陽性檢出率為91.7%，特異性分別為88.0%、84.0%、92.0%、84.0%、92.0%、88.0%，均明顯高于單個基因的檢測。兩個基因聯(lián)合的組間陽性檢出率及特異性未見明顯差異（P>0.05）。
　　4.三個基因聯(lián)合檢測時，CNRIP1、SNCA、SFRP2聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為93.3%，CNRIP1、SNCA、Vimentin聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為96.7%，SNCA、SFRP2、Vimentin

11、聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為96.7%，CNRIP1、SFRP2、Vimentin聯(lián)合檢測CRC的陽性檢出率為98.3%，特異性分別為88.0%、80.0%、84.0%、80.0%。三個基因甲基化聯(lián)合檢測與兩個基因甲基化聯(lián)合檢測進(jìn)行組間率的比較，結(jié)果為部分組合表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05)。三個基因聯(lián)合的組間陽性檢出率及特異性未見明顯差異（P>0.05）。
　　5.四個基因聯(lián)合檢測時，CRC的陽性檢出率為100%，特異性為80.

12、0%。將四個基因甲基化聯(lián)合檢測與三個基因甲基化聯(lián)合檢測進(jìn)行組間率的比較，結(jié)果未見明顯差異（ P>0.05）。兼顧高陽性檢出率和特異性，且檢測成本較低的最佳基因組合為SNCA/SFRP2/Vimentin(陽性檢出率為96.7%，特異性為84.0%)基因組合。
　　6.對SNCA/SFRP2/Vimentin組合進(jìn)行200例CRC高?；颊叩呐R床驗證，所有入組患者均行腸鏡檢查，以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，SNCA/SFRP2/Vimentin

13、基因組合對CRC的臨床敏感性為88.2%，特異性為84.1%；CRC商品化試劑盒篩查CRC的臨床敏感性為94.1%，特異性為90.2%，兩種檢測方法進(jìn)行組間率的比較，結(jié)果無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. MS-PCR法提示糞便中CNRIP1/SNCA/SFRP2/Vimentin在CRC患者中表現(xiàn)出較高的甲基化水平。
　　2. CRC患者糞便DNA中CNRIP1、SNCA、SFRP2、Vimentin基因的甲基化程度

14、與臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。
　　3.兩個基因聯(lián)合的陽性檢出率明顯高于單個基因的檢測，三個基因聯(lián)合優(yōu)于兩個基因，而四個基因進(jìn)行聯(lián)合檢測的陽性檢出率較三個基因的甲基化檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其中SNCA/SFRP2/Vimentin基因組合是兼顧陽性檢出率和特異性的最佳組合。
　　4.臨床標(biāo)本驗證提示SNCA/SFRP2/Vimentin基因的臨床敏感性及特異性為88.2%、84.1%；與CRC商品化試劑盒的檢測結(jié)果比較無明顯差