多形漢遜酵母表達平臺改進及牛FSHα、β亞基的表達.pdf

1、多形漢遜酵母(Hansenulapolymopha)是近幾年發(fā)展起來的作為真核細胞表達外源基因的一種甲醇酵母。我們利用本實驗室已有的漢遜酵母表達平臺，將其進行改造，將來自漢遜酵母的25SrDNA、18SrDNA構建到表達載體中，以提高外源基因拷貝數(shù)，并且利用漢遜酵母tRNA的豐富度及漢遜酵母密碼子的偏愛性設計不同的目的基因序列，以此來提到外源基因的表達量。通過報告基因綠色熒光蛋白(Modifiedgreenfluorescentprot

2、ein，mGFP5)和熒光素酶蛋白(fireflyluciferaseprotein,Luc)表明，我們所用的載體都完全可以在多形漢遜酵母中進行有效表達外源真核基因，而且保持天然蛋白的活性和特性，25SrDNA可以提高目的基因拷貝數(shù)，從而提高目的基因的表達量。 我們根據(jù)牛的促卵泡激素(FollicleStimulatingHormone，F(xiàn)SH)α亞基的cDNA序列合成了FSHα亞基的原始基因，同時又根據(jù)漢遜酵母tRNA的豐富度

3、及漢遜酵母的密碼子的偏愛性分別設計合成了FSHα亞基片段；根據(jù)Genbank報道的牛的促卵泡激素(FSH)β亞基cDNA序列合成了FSHβ亞基的原始基因片段。并將上述片段分別連到已構建的漢遜酵母表達載體pHFMD-Z-alpha-A上在漢遜酵母中進行了分泌表達，采用Ni+柱親和層析，用ELISA檢測和Westernblot分析表明，根據(jù)漢遜酵母tRNA的豐富度設計的牛FSHα亞基cDNA基因和原始β亞基cDNA基因完全可以在漢遜酵母中表

4、達，且FSHα亞基的表達量達2mg/L。將FSHα亞基構建到帶有25SrDNA的表達載體pHFMD-Z-alpha-A上與不帶5SrDNA的表達載體pHFMD-Z-alpha-A上在漢遜酵母中進行誘導表達，結果發(fā)現(xiàn)帶有25SrDNA的轉(zhuǎn)化子的表達量明顯高于不帶25SrDNA的轉(zhuǎn)化子。我們還比較了用甘油與甲醇做誘導劑的表達差異性，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導遠遠優(yōu)于甘油誘導。本實驗首次實現(xiàn)了促卵泡激素α亞基和β亞基在漢遜酵母中的表達，為實現(xiàn)牛促卵泡激素全